绵羊KAP11.1基因克隆、原核表达及皮肤毛囊表达研究

[目的]对毛囊角蛋白关联蛋白11.1(keratin associated protein 11.1,KAP11.1)基因进行克隆及原核表达,并对KAP11.1基因在不同品种绵羊皮肤毛囊中表达量进行比较,探究KAP11.1基因在南疆地方绵羊品种间表达差异及其对羊毛品质的影响.[方法]以平原型和田羊、山区型和田羊和卡拉库尔羊体侧皮肤毛囊为研究材料,以GenBank中绵羊KAP11.1基因序列(登录号:HQ595347.1)为参照设计引物,对KAP11.1基因进行PCR扩增,构建pMD19-T-KAP11.1克隆质粒,双酶切鉴定后构建pET-28a(+)-KAP11.1原核重组表达质粒,经PCR和双酶切鉴定后测序并进行序列分析,转化大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞中表达,采用SDS-PAGE和Western blotting检测;利用实时荧光定量PCR技术检测KAP11.1基因在不同绵羊皮肤毛囊中的表达情况.[结果]3种绵羊KAP11.1基因CDS区序列为480 bp,编码159个氨基酸,为不稳定的疏水蛋白.相似性比对结果发现,与参照基因相比,2种类型和田羊基因序列相似性均为99.79％,均在423 bp处发生突变,由C变为T,卡拉库尔羊基因序列相似性为99.38％,其69 bp处G变为T、93 bp处C变为T、423 bp处C变为T.系统进化树分析发现,3种绵羊和山羊亲缘关系最近,和瘤牛亲缘关系最远.KAP11.1蛋白二级结构主要由无规则卷曲组成.试验成功构建了pET-28a(+)-KAP11.1原核重组表达质粒,并纯化得到19 ku的KAP11.1蛋白.KAP11.1基因在山区型和田羊和卡拉库尔羊皮肤毛囊中的表达量均显著高于平原型和田羊(P＜0.05),在山区型和田羊和卡拉库尔羊中差异不显著(P＞0.05).[结论]克隆获得480 bp的绵羊KAP11.1基因CDS区序列,成功构建了pET-28a(+)-KAP11.1原核重组表达质粒,并获得19 ku的KAP11.1蛋白,且KAP11.1基因在3个品种绵羊皮肤毛囊中均有表达.