异色瓢虫丙酮酸激酶基因序列分析及其调控海藻糖代谢功能

[目的]丙酮酸激酶(pyruvate kinase,PYK)是一种调节性糖酵解酶,负责调节糖酵解和糖异生之间的平衡,具有重要的生理作用.本研究通过分析异色瓢虫(Harmonia axyridis)3条HaPYK的序列结构,并结合RNA干扰(RNAi)技术,探讨HaPYK在瓢虫体内的生物学功能.[方法]基于从异色瓢虫全基因组中获得的3条HaPYK序列(被分别命名为HaPYK1-1、HaPYK1-2、HaPYK2),通过生物信息学方法分析其理化性质和序列结构,以及与其他昆虫之间的同源性.然后采用显微注射的方法将体外合成的dsRNA导入羽化第1天成虫体内,在注射后48和72h分别收集试验材料,提取虫体总RNA后进行反转录,随后采用实时荧光定量PCR (qRT-PCR)技术测定3个HaPYK的表达水平以评估RNAi效果,并检测与海藻糖代谢相关基因的表达水平,最后检测葡萄糖、糖原、海藻糖含量以及两种海藻糖酶的活性.[结果]HaPYK1-1、HaPYK1-2、HaPYK2的开放阅读框分别为1350、1569、1656 bp;蛋白大小分别为449、522、551 aa,理论等电点分别为5.04、5.02、5.01.保守结构域预测表明3条HaPYK均属于Pyruvate_kinase超家族.HaPYK二级结构主要是α-螺旋和无规则卷曲,另外也含有延伸链和β-转角.3条序列的寡聚物类型均为同源四聚体.系统进化树显示,HaPYK与同为鞘翅目的昆虫具有较近的亲缘关系,如马铃薯甲虫(Leptinotarsa decemlineata)和赤拟谷盗(Tribolium castaneum).注射dsHaPYK1-1后,HaPYK1-2和HaTRE1-4的表达量显著下调,而HaPYK2、HaTRE1-1、HaTRE1-2、aTRE2-like、HaTPS的表达量显著上调;注射dsHaPYK1-2后,HaTRE1-1、HaTRE1-2、HaTRE1-3、HaTRE1-5、HaTRE2、HaTP的表达量显著上调;注射dsHaPYK2后,仅HaTRE1-1表达量在48h表现为显著上调,HaTRE1-3、HaTRE1-4、HaTRE1-5、HaTRE2、HaTRE2-like的表达量均下调.与对照组相比,在dsHaPYK1-2组中48h时可溶性海藻糖酶(TRE1)活性显著降低,海藻糖和糖原含量显著增加;在dsHaPYK1-1或dsHaPYK2组中48h时葡萄糖含量减少,72 h时葡萄糖、海藻糖含量增加,膜结合型海藻糖酶(TRE2)活性显著提高;在dsHaPYK2组48 h时,海藻糖含量显著减少,而糖原含量显著增加.[结论]异色瓢虫体内存在3个HaPYK,通过导入外源dsHaPYK能成功干扰靶标基因的表达水平,且抑制表达后海藻糖代谢会受到影响,但3个HaPYK的调控机制不尽相同.