棉花真叶原生质体分离及瞬时表达体系的优化

[目的]真叶细胞能模拟植物内源条件,建立基于棉花真叶原生质体的高效瞬时表达体系,为快速有效研究棉花基因功能提供方法.[方法]以陆地棉TM-1真叶为材料,采用常用的纤维素酶和离析酶组合分离原生质体,探究影响原生质体分离的叶龄、渗透压、酶解液成分和酶解时间,及渗透压和酶解时间对原生质体活力的影响,并分析渗透压、PEG浓度和培养液种类对原生质体瞬时转化的影响,进而优化棉花真叶原生质体瞬时表达体系.构建GhLTP-GFP表达载体,对比融合蛋白在拟南芥、棉花原生质体和烟草表皮细胞中的亚细胞定位,验证该体系.[结果]不同于棉花子叶,酶解液中高浓度CaCl2会显著抑制真叶细胞壁的酶解,含10 mmo1·L-1 CaCl2的酶解液能有效分离棉花真叶原生质体.甘露醇显著影响原生质体得率,含0.5 mo1·L-1甘露醇的酶解液分离原生质体得率最高,且细胞形态维持较好,而0.4 mol·L-1甘露醇条件下原生质体活力降低一倍,表明0.5 mol·L-1甘露醇能较好维持棉花真叶原生质体渗透压.陆地棉刚展平的真叶分离所得原生质体大小合适,而展平后的嫩叶分离得到的原生质体细胞较大,得率降低一倍.酶解处理7h前,原生质体游离缓慢,酶解9h原生质体产量达到高峰,继续酶解原生质体将破裂,得率降低.在等渗条件下用40％ PEG4000转化所得原生质体,转化效率最高,而普遍采用的低渗条件不利于棉花真叶原生质体的转化.转化后,用WI溶液继续培养原生质体,会引起原生质体的大量破裂,用含0.5 mol·L-1甘露醇的W5溶液继续培养,有利于原生质体形态的维持,转化率提高到90％.表达载体35S:GhLTP-GFP分别转入棉花、拟南芥原生质体和烟草表皮细胞,GFP信号在细胞中的定位结果一致.[结论]建立的棉花真叶原生质体瞬时表达体系,可获得8.10×106个/mL活力在95％以上的高质量原生质体,原生质体得率提高8倍,转化效率达到90％,可用于亚细胞定位、蛋白互作,以及代谢调控网络研究等.