EndoNUclease Heteroduplex Cleavage typing (ENUHCT) : une technique universelle de typage avec concept de preuve sur la détection des variants de spike du SARS-CoV-2

Introduction Le role epidemiologique et clinique des variants SARS-CoV-2 a demontre la necessite de techniques d’identification rapide a partir des prelevements cliniques. Nous avons developpe une technique de typage par clivage endonucleasique des heteroduplexes (ENUHCT). Elle repose sur le melange de deux produits PCR (une reference et un echantillon a etudier). Apres denaturation et rehybridation, on obtient des homoduplex (Ref/Ref, Var/Var) et potentiellement des heteroduplex (Ref/Var). La nuclease clive les heteroduplex creant des fragments de taille differente selon le nombre et la position des mutations. Par electrophorese capillaire, il est facile de detecter la presence de mutation(s) selon le nombre et a la taille des fragments. Materiels et methodes La preuve de concept a ete realisee avec des souches virales ( https://www.european-virus-archive.com/ ) cultivees en cellules Vero-E6 dans un laboratoire NSB3. Les extraits d’acides nucleiques correspondant a 500 prelevements cliniques identifies par sequencage ont ete etudies apres codage aveugle. Amplification PCR : les primers sens (TTACCAGATGATTTTACAGGC) et reverse (AGACTTTAGGTCCACAAAC) [400 nm] amplifient un fragment de 303 pb sous 25-μL avec 12,5 μL de 2X Reaction Mix, 0,5 μL de Superscript II RT/Platinum Taq Mix et 5 μL d’ARN de culture ou 3 μL d’ARN provenant d’echantillons biologiques (30 min/50 °C–2 min/94 °C, puis 40 fois 15 s/94 °C–20 s/55 °C–20 s/68 °C, puis 2 min/72 °C). Mismatch detection : les 2 produits de PCR sont melanges vol/vol. Apres denaturation/hybridation, les reactifs du Kit SURVEYOR (IDT) sont ajoutes suivant le protocole et incubes pendant 1 heure a 42 °C. Capillary electrophoresis : l’analyse des fragments est faite par electrophorese capillaire (Caliper GXII) sur puce ADNerkinElmer avec LabChip GX Reviewer. Sanger sequencing : les produits de PCR ont ete sequences par Genewiz. Resultats Les resultats obtenus sont en parfaite correspondance avec les resultats theoriques. En associant une souche europeenne avec variant UK on obtient 2 fragments (231/72 pb [mismatch en 501]) ; en associant variant UK et variant SA (180/123 pb [mismatch en 484]) ; en associant souche europeenne et variant SA on obtient 4 fragments (180/123/72/51 [mismatch en 484 et 501]). De meme, les resultats obtenus avec les prelevements cliniques nous ont permis d’identifier correctement les variants connus et d’identifier de nouveaux variants. Ces derniers ont ete confirmes par sequencage. Conclusion ENUHCT : – est simple, sensible, peu couteuse ; – permet de detecter les variants reconnus et de decouvrir des variants encore non repertories ; – peut etre appliquee a d’autres microorganismes ; – permet de typer plus de 1000 echantillons par jour.