可视化细胞色素b5蛋白的显色核心片段解析

[目的]本文旨在明确含Cyt-b5类血红素/类固醇结合结构域(Cyt-b5 D)显色片段的最佳长度及其与原核表达载体的普适性,并筛出有效的可视化标签,以期提高载体构建的效率和便捷性.[方法]分析二化螟Cyt-b5蛋白结构域,将其划分成含Cyt-b5 D的不同长度片段(OA、OB、OC等),并分别与3种原核表达载体pET-28a(+)、pET-41a(+)和pET-30a(+)进行连接和异源表达;将筛选的显色片段与二化螟RDL1基因融合表达,比较不同表达时间菌液的显色反应和吸光值;用亲和层析法纯化显色片段表达以及与RDL1表达的融合蛋白,然后进行Western blot检测.[结果]OA片段是最佳的显色片段,在3种原核表达载体中均可表达出红色的蛋白,且与RDL1融合表达时显色稳定,表明其具有普适性.在420 nm波长下的特征吸收峰可用于实时监测显色菌液的生长状态,而层析柱中的红色变化可用于判断蛋白纯化过程.此外,利用Western blot可检测到目的蛋白,表明显色片段的存在并未干扰目的蛋白的准确鉴定.[结论]Cyt-b5显色片段(OA)可作为原核表达系统的可视化标签,为蛋白表达和纯化等试验操作提供指示标记,从而提高其操作的便捷性和时效性.