泛素结合酶E2C通过特异性结合β-微管蛋白参与调控肝细胞癌进展

目的 筛选泛素结合酶E2C(UBE2C)的底物蛋白,并探讨其在肝细胞癌进展中的作用.方法 构建带有Halotag标签的UBE2C过表达质粒,将UBE2C与Halotag在人高转移肝癌细胞系HCCLM3中融合表达,通过Halolink树脂沉淀UBE2C结合的底物蛋白,并联合SDS-PAGE和质谱对底物蛋白进行鉴定.在人肝癌细胞系Huh-7中过表达UBE2C,通过qRT-PCR、蛋白质印迹分析和细胞免疫荧光实验检测UBE2C过表达对其底物蛋白表达的影响,利用细胞核质分离结合蛋白质印迹分析及TOP flash/FOP flash荧光素酶报告基因实验检测UBE2C过表达对Wnt信号通路的影响,并进一步通过qRT-PCR和蛋白质印迹分析验证UBE2C过表达对Wnt信号通路下游基因表达的影响.结果 Halotag共沉淀产物经SDS-PAGE和银染后所获得差异条带的质谱鉴定结果显示,β-微管蛋白是UBE2C结合的底物蛋白.与对照组相比,过表达UBE2C降低了Huh-7细胞中β-微管蛋白在蛋白水平的表达(P<0.01),但对其在mRNA水平的表达没有影响(P>0.05).同时,过表达UBE2C促进了β-联蛋白入核(P<0.05),提高了TOP flash/FOP flash荧光素酶活性(P<0.01),增强了Wnt信号通路下游基因JNK、细胞周期蛋白D1和基质金属蛋白酶7的表达(P均<0.05).结论 UBE2C通过特异性结合β-微管蛋白降低肝癌细胞中β-微管蛋白水平,从而提高Wnt信号通路活性,促进其下游基因表达,进而参与调控肝细胞癌的进展.