甘草黄酮亚组分及甘草黄酮C对TNF-α致肠上皮屏障损伤的保护作用研究

目的:从甘草黄酮中筛选活性亚组分及黄酮单体,考察其对肿瘤坏死因子-α(TNF-α)诱导的肠上皮屏障损伤的保护作用.方法:以硅胶柱色谱法制备甘草黄酮亚组分;体外培养肠上皮细胞IEC-6并以TNF-α诱导炎症反应,分别以甘草黄酮亚组分(20μg·mL-1)提前干预,CCK-8法检测正常细胞存活率,酶联免疫吸附分析(ELISA)检测炎症细胞白细胞介素-6(IL-6)分泌水平,获得活性亚组分;高效液相色谱法(HPLC)确认活性亚组分的主要成分,进而以TNF-α诱导的Caco-2单层细胞肠道屏障损伤模型分别考察活性亚组分GCH15(5、10、20μg·mL-1)和甘草黄酮C(LicoC,5、10、20μmol·mL-1)对肠道屏障的保护作用,ELISA检测IL-6和IL-8分泌水平,电阻仪检测单层细胞跨上皮电阻(TEER),以异硫氰酸荧光素-右旋糖酐(FD-40)相对通过水平评估细胞旁通透性,免疫印迹法(Western blot)检测闭合小环蛋白-1(ZO-1)、咬合蛋白(Occludin)和肌球蛋白轻链激酶(MLCK)表达.结果:制备得到甘草黄酮亚组分GCH1～GCH20;GCH2、GCH4、GCH8、GCH15和GCH1920μg·mL-1均可显著抑制IL-6分泌(P<0.05),且以GCH15的细胞毒性最小;通过HPLC确认了GCH15的主要成分是LicoC;以TNF-α刺激Caco-2细胞,可明显促进IL-6和IL-8分泌(P<0.01),降低TEER值(P<0.01),提高FD-40相对通过水平(P<0.01),下调ZO-1和Occludin表达(P<0.01),促进MLCK表达(P<0.01).以GCH15和LicoC提前干预则可抑制IL-6和IL-8分泌(P<0.01),增加Caco-2单层细胞TEER值(P<0.01),降低FD-40相对通过水平(P<0.01),并呈一定的剂量相关性,说明两者可以逆转TNF-α引起的炎症反应及细胞屏障功能紊乱.Western blot结果表明,GCH1520μg·mL-1和LicoC 20μmol·mL-1均能促进ZO-1和Occludin表达(P<0.05,P<0.01),抑制MLCK表达(P<0.01).结论:GCH15和LicoC均可明显缓解TNF-α引起的Caco-2细胞炎症反应及屏障功能紊乱,两者对屏障功能的调节作用可能是通过调控MLCK通路,进而促进紧密连接蛋白表达实现的.