牛病毒性腹泻病毒离子孔道蛋白p7多肽多克隆抗体的制备和鉴定

牛病毒性腹泻病毒(Bovine viral diarrhea virus,BVDV)非结构蛋白p7因其离子通道活性被称为病毒孔蛋白,参与病毒进入、释放和复制的过程.为了深入研究p7蛋白形成离子通道的机理,使用人工合成的多肽制备p7特异性多克隆抗体.根据GenBank中BVDV毒株NADL p7氨基酸序列信息,进行生物信息学分析,合成表面抗原多肽并偶联血蓝蛋白(keyhole limpet hemocyanin,KLH)作为载体蛋白,经反相高效液相色谱(reversed-phase-high performance liquid chromatography,RP-HPLC)纯化、纯度分析,用质谱进行定性鉴定;使用弗氏佐剂进行乳化后,对新西兰大白兔进行皮下多点注射免疫,免疫剂量为400μg/只,连续5次免疫,免疫后10 d时采用多肽亲和柱纯化血清,获得多肽多克隆抗体,使用间接ELISA和SDS-PAGE进行抗体效价和纯度检测;BVDV NADL感染牛肾细胞MDBK后使用免疫荧光染色检测多肽多克隆抗体的反应性和特异性.生物信息学分析p7蛋白的主要抗原表位分布在氨基端,偶联KLH后合成多肽MSQYGAGEIVM MGN-Cys-KLH,经RP-HPLC纯化后多肽纯度可达80.19％,分子量为794.2 Da;经过5次免疫并使用多肽亲和柱纯化血清后,间接ELISA检测多肽多克隆抗体效价为1:100000,Western blot检测抗体的纯度为90.2％;使用免疫荧光染色检测发现该抗体在BVDV NADL感染的MDBK细胞的细胞膜上呈现阳性染色,与p7离子孔道定位相符.成功制备兔抗BVDV p7多肽多克隆抗体,具有较好的反应性和特异性,为进一步研究p7形成离子孔道的机理提供了有利工具.