GII.P16型诺如病毒聚合酶蛋白的原核表达、活性测定和结晶

目的:原核表达GII.P16型诺如病毒RNA依赖RNA聚合酶（RNA-dependent RNA polymerase，RdRp）蛋白，并对其进行生物活性测定和晶体制备。方法:首先通过RT-PCR方法获得GII.P16 RdRp完整基因并将其克隆至携带His-Tag PET28a载体，构建重组表达质粒，然后转化至大肠杆菌BL21（DE3）感受态细胞，并用IPTG诱导RdRp的表达，最后利用SDS-PAGE和Western blot的方法鉴定蛋白的表达情况；采用His-Tag亲和层析和分子筛的方法纯化目的蛋白；分别使用体外酶催化实验和Hampton结晶试剂盒进行蛋白活性测定和晶体筛选。结果:构建了原核表达重组体PET28a-RdRp，并大量表达了相对分子质量约60 kDa的可溶性蛋白；经两次纯化后，获得了高纯度的目的蛋白，纯度达到90%以上；体外酶催化实验显示RdRp重组蛋白具有良好的生物活性；通过多种生长条件的筛选，获得了优质的RdRp晶体。结论:本研究成功获得的GII.P16 RdRp蛋白及其晶体，为理解其生物学功能和解析其晶体结构奠定了基础。