木麻黄SSR-PCR反应体系的建立与优化

为得到木麻黄SSR-PCR反应的最佳体系,以4个种(短枝木麻黄、山地木麻黄、粗枝木麻黄、细枝木麻黄)的24个无性系为材料,采用L16(45)正交设计对影响木麻黄SSR-PCR反应的4个因素(Taq酶、dNTP、Mg2+和引物)在4个水平上进行了优化,并利用直观分析和方差分析两种方法对PCR结果进行评价.结果表明:引物、Mg2+和dNTP均对木麻黄SSR-PCR反应结果有极显著的影响(P<0.01),影响程度由大到小为:引物>Mg2+>dNTP,而Taq酶对扩增结果无显著影响;确定了两种木麻黄SSR-PCR反应体系(体系6和体系15),体系6为1×PCR buffer、2ng模板DNA、0.5μmol·L-1引物、1.5 mmol·L-1 Mg2+、0.1 mmol·L-1 dNTP、0.5 U Taq酶;体系15为1×PCR buffer、2ng模板DNA、0.5μmol·L-1引物、1.75 mmol·L-1 Mg2+、0.2 mmol·L-1 dNTP、1.25 U Taq酶,反应体系共10μL,不足部分用ddH2O补足.从节约成本和降低非特异性产物的角度考虑可将体系6作为最佳体系,体系15为备用体系;本试验所选荧光引物M26、M36的退火温度在52～62℃均可扩增出清晰明亮的条带.为简化操作步骤和减少非特异性产物,可选择60℃作为引物M26、M36的最佳退火温度.