松材线虫和拟松材线虫双重RPA检测研究

旨在建立一种以重组酶聚合酶扩增技术(RPA)为基础的快速检测方法,用于松材线虫和拟松材线虫的同步检测鉴定.根据松材线虫和拟松材线虫ITS区差异序列,分别设计松材线虫和拟松材线虫特异性上游引物Bx-rpa-F、Bm-rpa-F和两者通用下游引物Bxm-rpa-R.优化3条引物在反应体系中的最佳配比,建立双重RPA检测体系,并对其特异性和灵敏度进行分析.研究结果显示,双重RPA在37℃恒温条件反应30 min,即可完成对松材线虫和拟松材线虫核酸的同步扩增.Bx-rpa-F/Bm-rpa-F/Bxm-rpa-R对松材线虫的扩增片段为346 bp,对拟松材线虫的扩增产物为189 bp,且三者配比为5:3:8时,双重RPA扩增效果最好.双重RPA对松材线虫和拟松材线虫具有较高的检测特异性,对松材线虫的检测极限为10 pg/μL,相当于1/100条线虫,对拟松材线虫的检测极限为100 pg/μL,相当于1/10条线虫,其灵敏度低于常规PCR技术,但其满足对单条线虫检测的需求.双重RPA从松木样品中同步检测到松材线虫和拟松材线虫,操作简便、检测效率高、特异性强、灵敏度高、对仪器设备要求低,为松材线虫的检疫鉴定提供新方法.