DNA损伤诱导转录因子4过表达可能通过Wnt/β-catenin信号通路抑制HT-22细胞增殖并促进其凋亡

神经管畸形(neural tube defects,NTDs)是一种由细胞增殖凋亡紊乱引起的先天缺陷性疾病.本室前期利用RNA-Seq技术,发现小鼠神经管畸形胚胎脑组织中DNA损伤诱导转录因子-4(DNA damage-inducible transcript 4,Ddit4)表达水平增加,但其在神经管畸形中的作用尚不清楚.本文拟探索Ddit4过表达对海马神经元HT-22细胞增殖和凋亡的影响及相关机制,从而为后续研究Ddit4在小鼠神经管畸形中的作用奠定基础.本研究首先根据小鼠Ddit4序列构建真核表达载体pEX-3-Ddit4,限制性酶切分析和测序结果表明pEX-3-Ddit4构建成功.qRT-PCR和Western印迹检测显示转染pEX-3-Ddit4后,HT-22细胞中DDIT4的表达水平明显增加(P＜0.01).CCK-8和Western印迹结果显示,Ddit4过表达导致HT-22细胞增殖下降(P＜0.01).流式细胞仪结果显示,转染pEX-3-Ddit4后,G0/G1期细胞比例增加、S期比例下降(P＜0.01),细胞凋亡率增加(P＜0.05).Western印迹检测发现,转染pEX-3-Ddit4能够显著上调切割胱天蛋白酶3(cleaved caspase3)水平(P＜0.05),表明Ddit4过表达促进HT-22细胞凋亡.细胞免疫荧光及Western印迹结果显示,过表达Ddit4显著降低细胞β-联蛋白(β-catenin)、T细胞因子4、细胞周期蛋白D1和C-myc的表达水平(P＜0.05),核内β-联蛋白减少,提示Ddit4过表达抑制了 Wnt/β-catenin信号通路.过表达Ddit4的同时加入Wnt/β-catenin信号通路激动剂LiCl处理细胞可逆转上述现象,表明Ddit4过表达可能通过Wnt/β-catenin信号通路对HT-22细胞发挥抗增殖和促凋亡作用.