人血浆中纤维蛋白溶酶原纯化工艺样品蛋白含量改良BCA检测方法的建立及验证

目的 建立检测人血浆中纤维蛋白溶酶原(plasminogen,Pg)改良PIerceTM BCA蛋白试剂盒方法(简称改良BCA法),并进行验证及初步应用.方法 结合PierceTM BCA试剂盒的试管法与微孔板法检测人血浆中Pg;比较标准曲线拟合方式确定改良试剂盒的线性范围;通过牛血清白蛋白(bovine serum albumin,BSA)国家标准品和PIerceTM BCA试剂盒附带的BSA标准品互相标定确定内控标准品;通过平行性试验分析BSA作为标准品检测Pg蛋白含量的可行性.验证方法的准确性、精密性及选择性.应用改良的BCA法检测Pg纯化过程的蛋白含量,并与凯氏定氮法和双缩脲法进行比较,同时检测201903003批Pg工艺纯化过程样品蛋白含量的相对纯度及比活性变化.结果 改良BCA法选择二次函数拟合,PIerceTM BCA试验盒线性范围为62.5～2000 μg/mL,试剂盒附带的BSA标准品(2000 μg/mL)用BSA国家标准品标定结果为2090 μg/mL,可作为内控标准品使用;Pg所在工艺组分浓度在250 ～2000 μg/mL时,内控BSA曲线与Pg曲线的平行性最好.内控标准品的高(1500 μg/mL)、中(750 μg/mL)、低(150 μg/mL)、检测下限(62.5μg/mL)及BSA国家标准品(2000 μg/mL)的回收率在88.61％～103.78％之间,批内及批间CV均＜10％;Pg工艺缓冲液中150 mmoL/L辛酸钠、259/L蔗糖、59/L甘氨酸、3％盐酸精氨酸对检测无影响,1％溶剂/去污剂(S/D)稀释至少40倍对检测无干扰.改良BCA法检测Pg纯化工艺的原液、半成品结果与双缩脲法和凯氏定氮法的符合性良好.201903003批工艺样品从原料血浆经过3步纯化后获得Pg半成品,其比活性从0.02 U/mg升至8.42 U/mg,相对纯度从0.19％升至81.94％.结论 成功建立了改良的BCA蛋白定量检测方法,该方法线性范围广,平行性、准确性、精密性及选择性良好,既可用于Pg纯化工艺中间品的质量监控,也可用于原液、半成品的蛋白含量检测.