柯萨奇病毒A2病毒样颗粒的制备、纯化及鉴定

目的 制备柯萨奇病毒A2(Coxsackievirus A2,CV-A2)病毒样颗粒(virus-like particles,VLPs),并对其进行纯化及鉴定.方法 将CV-A2 P1和3CD)基因序列根据昆虫细胞偏好特性进行密码子优化并人工合成,分别克隆至供体质粒pFastBacDual的多角体蛋白启动子(pPh)和pPIO启动子后,构建重组质粒pFastBacDualCV-A2 P1-3CD,转化至大肠埃希菌(E.coli)DH10 BacTM中,转座形成重组bacmid,再将重组-bacmid转染Sf9细胞,获得重组杆状病毒rBac-CV-A2 P1-3CD),经蔗糖垫底离心和氯化铯密度梯度离心法纯化rCV-A2 VLPs,SDS-PAGE、Western blot法检测浓度及纯度,透射电镜法观察VLPs颗粒形态.结果 质粒pFastBacDualCV-A2 P1-3CD经双酶切鉴定,重组Bacmid、rCV-A2 VLPs经PCR鉴定,均在预期目标条带处可见清晰条带;rCV-A2 P1-3CD蛋白经IFA鉴定可见明显荧光;rCV-A2 VLPs经SDS-PAGE及Western blot分析,均可见清晰的VPO(相对分子质量约39 000)、VP1(相对分子质量约34 000)和VP3(相对分子质量约27 000)条带;透射电镜观察纯化rCV-A2 VLPs,可见直径23-33 nmr的颗粒,形态和大小与CV-A2一致.结论 成功构建了 pFastBacDualCV-A2Pl-3CD重组Bacmid质粒,并成功表达了 rCV-A2 VLPs,为今后rCV-A2 VLPs疫苗的研发奠定了基础.