补阳还五汤通过调节自噬促进OGD/R损伤大鼠NSCs增殖、分化能力

目的:探讨补阳还五汤(BDT)对神经干细胞(NSCs)糖氧剥夺/复氧(OGD/R)损伤后增殖、分化的影响.方法:从SD大鼠海马区域分离培养NSCs,将细胞随机分为5组,分别为常氧组,模型组,BDT组,雷帕霉素(Rapa)组和自噬抑制剂3-甲基腺嘌呤(3-MA)联合BDT组,常氧组和模型组使用20％空白血清,BDT组使用20％含药血清,Rapa剂量1 μmol·L-1,3-MA剂量5mmol·L-1.除常氧组外,其余各组进行糖氧剥夺/复氧.光镜观察细胞形态的变化;免疫荧光检测巢蛋白(nestin)表达,鉴定NSCs;细胞增殖与活性检测法(CCK-8)检测NSCs的存活率;5-乙炔基-2-脱氧尿嘧啶苷(EdU)标记法检测NSCs增殖;Ad-mCherry-GFP-LC3B检测自噬活性;蛋白免疫印记法检测BDT对自噬相关蛋白的影响;免疫荧光法检测脑源性神经营养因子(BDNF),β-微管蛋白Ⅲ(β-tubulin Ⅲ)和胶质纤维酸性蛋白(GFAP).结果:与常氧组比较,糖氧剥夺/复氧会显著降低大鼠NSCs的细胞活力,与模型组比较,20％BDT含药血清明显改善了大鼠NSCs存活(P＜0.01).BDT可以诱导OGD后NSCs自噬小体的产生,与常氧组比较,微管相关蛋白轻链3Ⅱ(LC3Ⅱ),Beclin-1表达升高(P＜0.05,P＜0.01),p62变化不明显;与模型组比较,BDT组 LC3Ⅱ,Beclin-1 明显上调(P＜0.05,P＜0.01),p62表达下调(P＜0.01);Rapa组起到类似效果(P＜0.05,P＜0.01),3-MA组抑制了自噬的活性(P＜0.01).Ad-mCherry-GFP-LC3B结果显示,与常氧组比较,模型组荧光强度显著增加(P＜0.01);与模型组比较,20％BDT含药血清和Rapa组显著增加自噬荧光强度(P＜0.01),3-MA抑制了自噬活性(P＜0.01).免疫荧光结果显示,与常氧组比较,EdU,β-tubulin Ⅲ,GFAP和BDNF阳性细胞数显著减少(P＜0.01);与模型组比较,20％BDT含药血清和Rapa起到了类似的保护和促进作用(P＜0.05,P＜0.01);3-MA组可以部分阻断BDT的神经保护和分化能力(P＜0.05).结论:BDT预保护可以通过上调自噬减少糖氧剥夺造成的大鼠NSCs损伤,促进增殖、分化.