基于PI3K/AKT信号通路探讨白藜芦醇保护APP-NSCs的作用机制

目的:探讨白藜芦醇对高表达淀粉样前体蛋白(Amyloid precusor protein,App)基因的神经干细胞(APP-NSCs)的保护作用及其可能的作用机制.方法:从出生72 h内的C57BL/6小鼠脑室下区及海马区分离、培养原代NSCs,通过转染APP基因构建阿尔茨海默病(Alzheimer's disease,AD)NSCs模型,利用免疫荧光染色检测NSCs标志物神经巢蛋白(Nestin)与胚胎干细胞关键蛋白(Sox-2)表达以鉴定NSCs,并通过免疫荧光染色评价NSCs向星形胶质细胞、神经元及少突胶质细胞分化的能力.以白藜芦醇1、5、10、20 μmol/mL 或 LY294002 10 μmol/mL 孵育细胞.检测 NSCs 活力及乳酸脱氢酶(Lactate dehydrogenase,LDH)释放量;测量NSCs球半径并绘制生长曲线;5-溴脱氧尿嘧啶核苷(5-Bromo-2-deoxyUridine,BrdU)染色检测NSCs增殖能力;原位末端转移酶标记(Terminal deoxynucleotidyl transferase-mediated dUTP nick-end labeling,TUNEL)染色检测 NSCs 凋亡率;Real-time PCR 检测细胞中Bax、Bcl-2及 Caspase-3 mRNA 表达水平;蛋白质印迹法(Western blot)检测磷脂酰肌醇3-激酶(phosphatidylinositol 3-kinase,PI3K)、蛋白激酶B(Protein kinase B,AKT)及p-AKT蛋白表达情况.结果:与空白对照组比较,模型对照组细胞活力明显降低,LDH释放量明显升高,NSCs的增殖能力明显降低,细胞凋亡明显增多,Caspase-3 mRNA明显上调,Bax/Bal-2比值明显升高,且PI3K与p-AKT蛋白表达明显下调(P＜0.05);与模型对照组比较,白藜芦醇5、10、20 μmol/mL能明显提高APP-NSCs活力,降低LDH释放量(P＜0.05);白藜芦醇10 μmol/mL明显促进NSCs的增殖,并明显抑制其凋亡(P＜0.05);下调Caspase-3 mRNA表达,增加Bax/Bal-2比值,还能够上调PI3K与p-AKT蛋白表达(P＜0.05);白藜芦醇的上述作用可被LY294002 10 μmol/mL所抑制.结论:白藜芦醇对APP-NSCs具有保护作用,能促进APP-NSCs的增殖并抑制其凋亡,该作用机制可能与激活PI3K/AKT信号通路有关.