河弧菌AL536_RS29525基因功能研究

目的 探讨河弧菌基因组中VflT6SS2核心基因簇上游paar基因簇中AL536_RS29525的序列特征、对VflT6SS2分泌功能和杀菌活性的影响以及可能的调控机制.方法 利用Muscle、GeneDoc软件进行AL536_RS29525基因编码产物的序列特征分析;同源重组技术构建AL536_RS29525的缺失株,PCR扩增AL536_RS29525编码序列克隆于pSRKTc获得回补质粒pSR-29525,继而导入ΔAL536_RS29525得到回补株;Western Blot(WB)检测相应菌株中VflT6SS2 Hcp蛋白的表达和分泌,以大肠埃希菌为prey的细菌竞争/杀菌实验检测VflT6SS2介导的菌株杀菌能力;基于Lux报告基因的启动子融合系统冷光检测确定AL536_RS29525缺失对VflT6SS2核心基因簇启动子和htcp启动子活性的影响;荧光定量反转录聚合酶链式反应(qRT-PCR)检测hcp(tssD2)和vipA(tssB2)mRNA的相对表达水平.结果 AL536_RS29525同源基因编码蛋白的结构和功能较为保守;缺失AL536_RS29525负性影响VflT6SS2 Hcp蛋白的表达及分泌,降低VflT6SS2介导的菌株杀菌能力,回补AL536_RS29525可恢复缺失株Hcp的表达、分泌和杀菌能力;缺失株ΔAL536_RS29525中hcp(tssD2)和vipA(tssB2)的mRNA表达量均低于野生株;而VflT6SS2的核心基因簇启动子和hcp启动子活性在ΔAL536_RS29525缺失株和野生株之间无显著差异.结论 河弧菌AL536_RS29525基因较为保守,与霍乱弧菌以及弗尼斯弧菌的同源基因均具有较高的同源性.AL536_RS29525基因是河弧菌VflT6SS2的重要组成部分,为其Hcp效应子的正常表达、分泌功能以及VflT6SS2介导的杀菌活性所必需.AL536_RS29525可能转录后水平影响VflT6SS2的功能表达.