原花青素干预缺血缺氧状态下骨骼肌卫星细胞的增殖和分化

背景:肢体缺血性损伤主要是由外周动脉疾病引起的,外科治疗可以恢复肢体的血液供应,但缺血再灌注仍然会加重组织损伤,减少氧化应激和促进受损骨骼肌再生可能有利于缺血肢体的治疗.目的:探讨原花青素对缺血缺氧状态下骨骼肌卫星细胞增殖和分化能力的影响.方法:购买原代培养骨骼肌卫星细胞,取第2代细胞进行实验.以生理盐水组为对照组、2.5 mg/L或5 mg/L的原花青素作为实验组,将各组细胞置于低氧(体积分数1％的O2)、低血清(体积分数1％的胎牛血清)环境中培养,于不同时间点观察细胞.在第1,2,3,4天应用CCK8法检测细胞增殖情况;于第1天收集细胞,应用流式细胞仪检测细胞周期;提取细胞总蛋白,应用免疫印迹法检测增殖相关蛋白、细胞肌原性标志基因及通路相关蛋白的表达,并用共聚焦显微镜观察肌管形态.为进一步明确P38-MAPK信号通路在其间的作用,分别设置4组,分别为生理盐水组(对照组)、原花青素组、生理盐水+P38-MAPK通路抑制剂组、原花青素+P38-MAPK通路抑制剂组,观察各组细胞肌原性标志基因及相关通路蛋白表达情况.动物实验方案经西南医科大学动物实验伦理委员会批准,对小鼠行后肢缺血造模后,随机分为对照组和实验组(n=12),分别腹腔注射无菌注射用水及20 mg/kg原花青素,取干预7 d后小鼠的腓肠肌,苏木精-伊红染色法观察小鼠肌肉再生情况.结果与结论:(1)细胞实验结果:①缺血缺氧第1,2,3,4天,不同质量浓度原花青素组增殖能力均明显高于对照组,差异有显著性意义(P<0.05);②缺血缺氧第1天,不同质量浓度原花青素组增殖细胞核抗原蛋白表达水平均明显高于对照组,差异有显著性意义(P<0.05);③缺血缺氧第1天,不同质量浓度原花青素组S期细胞数目均明显高于对照组,差异有显著性意义(P<0.05);④缺血缺氧第3,5天,不同质量浓度原花青素组肌原性标志基因表达与肌管的形成均明显高于对照组,差异有显著性意义(P<0.05);以上指标不同质量浓度原花青素组间相比,差异均无显著性意义(P>0.05);⑤缺血缺氧第3天,原花青素组p-P38-MAPK信号通路蛋白的表达明显高于对照组,差异有显著性意义(P<0.05);生理盐水+P38-MAPK通路抑制剂组与原花青素+P38-MAPK通路抑制剂组间对比差异无显著性意义(P>0.05);(2)动物实验结果:小鼠下肢缺血第7天,原花青素组缺血腓肠肌每横断面积内中央核纤维/总肌纤维明显高于对照组,差异有显著性意义(P<0.05);(3)提示原花青素可促进缺血缺氧状态骨骼肌卫星细胞增殖,同时通过激活P38-MAPK信号通路诱导骨骼肌卫星细胞分化、肌原性标志基因表达和肌管形成,从而促进缺血损伤骨骼肌再生,修复受损肌纤维,发挥重要的保护作用.