利用Tet-On系统构建稳定表达Pdx1的小鼠ESC细胞株

目的:利用Tet-On系统构建稳定表达胰十二指肠同源异形框1(Pdx1)的小鼠胚胎干细胞(ESC)株,为进一步研究Pdx1+定型内胚层细胞向胰腺细胞分化奠定了基础.方法:采用Tet-On系统构建具有绿色荧光蛋白标记及嘌呤霉素抗性的Pdx1过表达慢病毒载体并感染胚胎干细胞.实验分为空白对照组(ESC组)、空载慢病毒对照组(PDX1-ESC组)和Pdx1慢病毒转染组(PDX1+ESC组).流式细胞术检测多西环素(DOX)筛选后转染细胞的阳性率;检测Tet-On系统功能及Pdx1的mRNA和蛋白表达.流式细胞分选仪分选转染细胞,构建稳定表达Pdx1基因的ESC株及阴性对照ESC株.结果:(1)DOX筛选后PDX1-ESC组的转染细胞阳性率为90.72％,PDX1+ESC组的转染细胞阳性率为94.01％.用流式细胞分选仪分选后PDX1-ESC组的转染细胞阳性率为97.84％,PDX1+ESC组为98.13％.(2)加入DOX后,PDX1-ESC组和PDX1+ESC组可见绿色荧光.PDX1+ESC组Pdx1的mRNA和蛋白表达明显增高(P<0.05).不加DOX,则3组细胞均未见绿色荧光,且Pdx1 mRNA和蛋白表达的差异无统计学显著性(P>0.05).(3)细胞株冻存3个月后复苏培养仍然存活,并受DOX调控.结论:利用Tet-On系统成功构建可诱导表达Pdx1的小鼠ESC株,为研究Pdx1+定型内胚层细胞向胰腺细胞分化提供了有效的细胞模型.