乙胺嘧啶对巨噬细胞叶酸水平及免疫功能的影响

目的 探讨抗弓形虫药物乙胺嘧啶对巨噬细胞叶酸水平和免疫功能的影响.方法 将小鼠巨噬细胞RAW264.7(1×104个/孔)接种于96孔板中,用0(对照组)、0.01、0.05、0.10、0.50、1.00、5.00、10.00、50.00、100.00、500.00和1000.00 μmol/L的乙胺嘧啶分别处理24 h后,CCK8检测细胞活性抑制率.将RAW264.7细胞(5×105个/孔)接种于6孔板中,弓形虫RH株速殖子感染后3h,用0(对照组)、0.10、1.00、10.00和100.00 μmol/L的乙胺嘧啶分别处理24 h,实时荧光定量PCR (qRT-PCR)检测弓形虫速殖子的二氢叶酸还原酶的表达.TRIzol试剂提取RAW264.7细胞的总RNA,qRT-PCR检测巨噬细胞二氢叶酸还原酶和炎症因子基因的表达,Western blotting检测巨噬细胞DHFR的蛋白表达,全自动化学发光免疫分析仪检测胞内活性叶酸水平.用BLAST对速殖子DHFR蛋白和小鼠巨噬细胞DHFR蛋白的氨基酸序列进行同源比对.用无叶酸培养基预处理RAW264.7细胞48 h,随后用100μmol/L的乙胺嘧啶处理24 h,qRT-PCR检测元叶酸条件下巨噬细胞炎症因子基因的表达.两组之间比较采用t检验,多重比较采用单因素方差分析.结果 CCK8检测结果显示,乙胺嘧啶的细胞活性抑制率具有剂量依赖效应,在0.01～0.10 μmol/L时可促进巨噬细胞的轻度增殖,浓度高于0.10 μmol/L时显示有抑制细胞增殖作用.qRT-PCR检测结果显示,0.10、1.00、10.00和100.00 μmol/L组弓形虫二氢叶酸还原酶mRNA相对转录水平分别为1.190±0.054、1.460±0.206、0.468±0.077和0.399±0.073,1μmol/L组高于对照组,10.00和100.00μmol/L组均低于对照组(P＜0.01);而巨噬细胞二氢叶酸还原酶mRNA相对转录水平分别为0.789±0.505、1.820±0.119、2.120±0.140和2.080±0.189,其中1.00、10.00和100.00 μmol/L组均高于对照组(P＜ 0.05或0.01).Western blotting分析结果显示,100.00 μmol/L组巨噬细胞DHFR蛋白表达显著高于对照组.BLAST同源比对显示,速殖子DHFR蛋白和小鼠巨噬细胞DHFR蛋白的同源性仅为37.0％.化学发光免疫分析结果显示,100.00 μmol/L组巨噬细胞的胞内活性叶酸水平为(10.600±2.930) nmol/L,高于对照组(P＜0.01).100 μmol/L乙胺嘧啶处理后,巨噬细胞炎症相关指标TNF-α、iNOS、Arg-1和IL-1β的mRNA相对转录水平分别为2.230±0.100、11.800±1.350、3.610±0.256和7.810±0.987,均高于对照组(P＜ 0.05或0.01).乙胺嘧啶处理后,无叶酸培养组RAW264.7细胞TNF-α、iNOS、Arg-1和IL-1β的mRNA相对转录水平分别为2.460±0.026、1.330±0.091、0.974±0.141和0.997±0.018,iNOS、Arg-1和IL-1β低于含叶酸正常组(P＜0.05或0.01),TNF-α高于含叶酸正常组(P＜0.01).结论 乙胺嘧啶可以通过促进小鼠巨噬细胞二氢叶酸还原酶的表达,升高胞内活性叶酸水平,从而诱导巨噬细胞炎症因子基因表达.