PD-1敲除及GPC3修饰的嵌合抗原受体T细胞治疗肝癌的实验研究

目的 构建程序死亡受体1(PD-1)敲除及磷脂酰肌醇蛋白多糖-3(GPC3)修饰的嵌合抗原受体T细胞(GPC3-PD1gRNA-CART cells),研究其对肝癌细胞株HepG2的体外杀伤作用,以及其对肝癌动物模型的体内抗肿瘤作用.方法 制备GPC3-PD1gRNA-CART细胞,用流式细胞仪检测PD-1、GPC3 CAR的表达情况.体外实验中,设立不同的效靶比(1:1、2:1、4:1),用LDH法测定刀豆蛋白刺激后的GPC3-PD1gRNA-CART细胞体外对HepG2细胞株的杀伤率,检测刀豆蛋白刺激后的GPC3-PD1gRNA-CART细胞和HepG2细胞株共孵育18 h后的细胞培养上清液中IFN-γ的释放水平.设置受刀豆蛋白A刺激的和未受刀豆蛋白A刺激的GPC3修饰的CART细胞(GPC3 CART cells)作为对照组.于重度免疫缺陷小鼠(NDG小鼠)皮下注射HepG2细胞建立肝癌动物模型,观察GPC3-PD1gRNA-CART细胞体内抑瘤作用.实验分为模型组、实验组(GPC3-PD1gRNA-CART组、GPC3 CART组),模型组和实验组通过皮下注射1×106个HepG2细胞造模,在肿瘤长径达3 mm后实验组经尾静脉注射5×106个GPC3-PD1gRNA-CART细胞或GPC3 CART细胞,模型组经尾静脉注射0.9％NaCl,每周注射1次,共3周,注射体积均为0.2 ml.每隔2天观测肿瘤体积情况,治疗3周后取皮下肿瘤组织,HE染色检测肿瘤组织情况.结果 流式细胞术分析结果显示,GPC3 CAR表达率为98.8％.GPC3 CART细胞PD-1的表达率为11.1％,经刀豆蛋白A刺激后,PD-1的表达率上升至92.1％,而GPC3-PD1gRNA-CART细胞的PD-1表达率仅为60％,证实了PD-1有效敲除.当效靶比为1:1、2:1、4:1时,随着效靶比的增加,刀豆蛋白刺激后的GPC3-PD1gRNA-CART细胞对HepG2的杀伤效果和IFN-γ 的释放水平也随着效靶比的增加而增加.相同效靶比的情况下,刀豆蛋白A刺激后的GPC3-PD1gRNA-CART细胞对HepG2细胞的杀伤效果显著高于刀豆蛋白A刺激后的GPC3 CART细胞对HepG2细胞的杀伤效果(P<0.05),且刀豆蛋白A刺激后的GPC3-PD1gRNA-CART细胞和HepG2细胞共孵育后IFN-γ 的释放水平也显著高于刀豆蛋白A刺激后的GPC3 CART细胞和HepG2细胞共孵育后IFN-γ 的释放水平(P<0.05),证明PD-1的敲除可以逆转CART细胞的功能抑制.治疗3周后GPC3-PD1gRNA-CART组抑瘤率为87.30％,与GPC3 CART组(69.03％)和模型组相比均有显著性差异(P<0.05).肿瘤组织HE染色检测结果显示,相比模型组,实验组肿瘤细胞显著减少,GPC3-PD1gRNA-CART组治疗效果优于GPC3 CART组.结论 GPC3-PD1gRNA-CART细胞可解决肿瘤逃逸问题,能于体内外高效靶向杀伤肿瘤细胞,为后续肝癌治疗提供技术基础.