体外构建3D细胞压力培养模型研究压力对增生性瘢痕成纤维细胞的作用

目的 采用Flexcell-5000C压力系统和鼠尾Ⅰ型胶原构建3D细胞压力培养模型,在体外细胞水平探讨压力对增生性瘢痕成纤维细胞(HSFb)的作用.方法 胶原酶消化法分离培养原代HSFb,采用Flexcell-5000C压力系统和鼠尾Ⅰ型胶原体外构建HSFb 3D培养模型.实验分为对照组(未施压)、10 mmHg压力组、20 mmHg压力组、30 mmHg压力组.通过免疫荧光观察不同压力下HSFb的表型变化;Ki-67/Edu免疫荧光染色检测HSFb增殖能力;Annexin-V-PI流式双染检测HSFb凋亡;PI流式单染检测HSFb细胞周期;划痕实验检测HSFb迁移能力.数据比较采用单因素方差分析和LSD-t检验.结果 激光共聚焦显微镜下可见HSFb表型随着压力增大逐渐向正常皮肤成纤维细胞(FB)转变,且在30 mmHg压力下最显著;Ki-67/Edu免疫荧光染色显示:HSFb增殖能力与压力值成反比,20 mmHg、30 mmHg组较对照组HSFb增殖能力显著降低(F=10.61,P=0.0037),而其余各组组间HSFb增殖能力差异无统计学意义(P＞0.05);Annexin-V-PI流式双染显示:相比于对照组、10 mmHg压力组、20 mmHg压力组及30 mmHg压力组HSFb早期凋亡率显著升高,差异有统计学意义(F=103.8,P ＜0.0001),而10、20 mmHg压力组HSFb早期凋亡率较对照组差异无统计学意义(P＞0.05);PI流式单染结果显示:相比于对照组、10 mmHg压力组及20 mmHg压力组,30 mmHg压力组G0/G1期HSFb百分比显著升高(F=21.58,P=0.0003),S期及G2/M期HSFb百分比显著下降(F=93.89、54.11,P＜0.001、=0.0066);相比于对照组,10 mmHg及20 mmHg G0/G1期HSFb百分比显著升高,S期及G2/M期HSFb百分比显著下降(P＜0.05);而20 mmHg与10 mmHg相比,HSFb细胞周期差异无统计学意义(P＞0.05);划痕实验结果显示,与对照组相比,30 mmHg压力组HSFb迁移能力明显下降(t=10.66,P=0.004).结论 基于Flexcell-5000C压力系统和鼠尾Ⅰ型胶原构建的3D细胞压力培养模型便捷稳定,压力值实时可调可控,成功验证了压力能够抑制HSFb增殖、迁移,且促进其凋亡及向Fb转分化的作用,并初步证实了30 mmHg为最佳压力值,为HS压力治疗提供了新的研究思路和体外模型.