人脐带间充质干细胞外泌体对大鼠肌腱损伤的修复效果及其机制

目的:探讨人脐带间充质干细胞(hUC-MSC)外泌体对大鼠肌腱损伤的修复效果及其机制。方法:培养hUC-MSC，通过流式细胞仪鉴定其表面标志物，通过特定培养基促使细胞成骨、成软骨、成脂三向分化。使用外泌体分离柱从细胞上清中分离外泌体，并通过透射电镜、外泌体绿色荧光标记染料(PKH67)染色和Western blot鉴定外泌体。40只Wistar大鼠采用手术切除的方法建立跟腱损伤模型，按随机数字表法分为hUC-MSC外泌体组(A组，在损伤部位注射100 μg外泌体)和对照组(B组，在损伤部位注射250 μl生理盐水)，每组20只。术后4周，通过q-PCR、Western blot和免疫荧光检测各组肌腱组织中转化生长因子-β(TGF-β)、骨形态发生蛋白-2(BMP-2)、血管内皮生长因子(VEGF)、成纤维细胞生长因子-2(FGF-2)、白细胞介素-1β(IL-1β)和肿瘤坏死因子-α(TNF-α)的表达水平，通过免疫组化方法检测各组损伤组织中胶原蛋白Ⅲ的表达情况。结果:分离培养的hUC-MSC在倒置显微镜下呈梭形，细胞经成骨分化后，出现立方体结节状结构，茜素红染色阳性。成脂分化后，细胞内部出现脂肪，油红O染色呈红色。成软骨分化后，细胞分泌大量氨基葡聚糖，阿利辛蓝染色强阳性。hUC-MSC外泌体经PKH67染色鉴定证实，在透射电镜下呈圆盘状、内部凹陷结构，Westen blot检测高表达移动相关蛋白-1(CD9)和溶酶体相关膜蛋白3(CD63)。q-PCR结果表明，A组TGF-β(4.887±0.767)、BMP-2(3.079±0.150)、VEGF(3.108±0.508)、FGF-2(4.211±0.522)的mRNA表达水平显著高于B组(分别为1.000±0.062、0.918±0.129、1.004±0.103、1.010±0.169)( P<0.01)，而IL-1β(0.697±0.037)、TNF-α(0.793±0.021)的mRNA表达水平显著低于B组(分别为1.004±0.089、1.006±0.015)( P<0.01)。Western blot检测A组TGF-β(1.434±0.041)、BMP-2(1.798±0.177)、VEGF(1.552±0.113)、FGF-2(1.357±0.039)的蛋白表达水平显著高于B组(分别为1.002±0.032、0.992±0.068、1.007±0.070、0.994±0.051)( P<0.01)，而IL-1β(0.705±0.016)、TNF-α(0.840±0.045)的蛋白表达水平显著低于B组(分别为1.000±0.016、1.003±0.040)( P<0.01)。免疫荧光显示，A组TGF-β、VEGF的阳性表达率与B组差异无统计学意义( P>0.05)，而BMP-2(2.278±0.208)、FGF-2(4.656±0.106)的阳性表达率显著高于B组(分别为0.315±0.101、1.661±0.110)( P<0.05或0.01)，IL-1β(1.677±0.947)、TNF-α(1.520±0.088)的阳性表达率显著低于B组(分别为4.296±0.291、2.373±0.273)( P<0.01)。A组肌腱胶原纤维排列规则且紧密，胶原蛋白Ⅲ的表达较为明显，而B组肌腱胶原纤维排列较为松散伴破损的瘢痕样愈合。 结论:hUC-MSC外泌体可促进大鼠损伤肌腱的修复，可能与其上调生长因子TGF-β、BMP-2、VEGF、FGF-2及胶原蛋白Ⅲ的表达，抑制炎性因子IL-1β、TNF-α的表达有关。