Wiskoot-Aldrich综合征蛋白家族成员3对乳腺癌细胞增殖、迁移侵袭及伪足形成的影响

目的:观察Wiskoot-Aldrich综合征蛋白家族成员3(WASF3)对乳腺癌细胞增殖、迁移侵袭及伪足形成的影响。方法:利用免疫蛋白印迹(Western blot)法检测乳腺癌细胞(BT-549、HCC-1937、BT-474、MDA-MB-231、MCF-7、T-47D)及乳腺正常细胞(MCF-10A)中WASF3蛋白的表达量；获取WASF3互补脱氧核糖核苷酸(cDNA)，构建过表达及干扰的重组载体SB-16-WASF3和pHB-U6-MCS-PGK-PURO-shWASF3(pHB-shWASF3)。重组干扰质粒经慢病毒包装，感染MDA-MB-231细胞，经抗性筛选建立WASF3基因静默的稳转细胞株。经实时荧光定量反转录聚合酶链反应(RT-qPCR)及Western blot法验证WASF3的静默及过表达效率；通过克隆形成实验和迁移侵袭实验分别验证细胞克隆形成能力和迁移侵袭能力的变化；过表达载体SB-16-WASF3转染MDA-MB-231细胞，经WASF3抗体和鬼笔环肽(Phalloidin)双染色，观察WASF3过表达对细胞伪足形成的影响。采用单因素方差分析，组内进一步两两比较采用LSD- t检验，两两比较采用 t检验。 结果:Western blot结果显示，不同乳腺癌细胞WASF3蛋白的相对表达量分别为1.07±0.00、0.54±0.11、0.60±0.14、1.36±0.02、0.65±0.05和0.79±0.18，均高于乳腺正常细胞(0.38±0.01， t＝134.864、21.289、24.883、55.397、8.892、37.363， P值均<0.05)，差异均有统计学意义；且MDA-MB-231和BT-549细胞的表达量相对较高。细胞增殖实验显示WASF3静默组(pHB-shWASF3-1)在24、48、72、96、120 h的增值率均低于对照组pHB-shNegetive Control组(pHB-shNC)及空白对照(Control)(0.92±0.06比1.18±0.05比1.14±0.03、1.42±0.05比1.90±0.12比1.77±0.14、2.02±0.03比2.83±0.08比2.70±0.10、2.78±0.02比3.78±0.03比3.70±0.17、3.22±0.04比4.10±0.12比4.02±0.10， t24 h＝7.983、 t48 h＝9.024、 t72 h＝23.491、 t96 h＝66.348、 t120 h＝17.114； t24 h＝8.453、 t48 h＝5.843、 t72 h＝15.813、 t96 h＝13.479、 t120 h＝19.142， P值均<0.01)，差异均有统计学意义，但后两组间差异无统计学意义。pHB-shWASF3-1组克隆形成率[(25.50±2.00)%]低于pHB-shNC组及Control组[(62.33±2.57)%、(64.17±3.21)%， F＝204.754]。迁移实验结果显示pHB-shWASF3-1组穿过小室的细胞数低于pHB-shNC组和Control组[(212.33±14.01)个比(357.33±8.02)个比(364.33±9.07)个， F＝193.200， P<0.01]，差异均有统计学意义，但后两组间差异无统计学意义。侵袭实验结果显示pHB-shWASF3-1组穿过小室的细胞数低于pHB-shNC组和Control组[(151.33±5.51)个比(212.33±14.01)个比(215.00±6.08)个， F＝44.269， P值均<0.01]，差异均有统计学意义，但后两组间的差异无统计学意义。免疫荧光结果可见，WASF3过表达组的红色信号(WASF3染色)明显高于对照组，绿染的肌动蛋白(F-actin)在细胞边缘明显聚集，细胞伪足伸展更明显。 结论:WASF3在乳腺癌细胞中呈高表达，静默WASF3后可抑制乳腺癌细胞的增殖、克隆形成及迁移侵袭能力；过表达WASF3后可促进乳腺癌细胞F-action蛋白的堆积，促进细胞片状伪足的形成。