克洛己新干混悬剂通过PI3K/AKT信号通路改善铜绿假单胞菌诱发的小鼠急性肺炎

目的 探究克洛己新干混悬剂对铜绿假单胞菌(PA)诱导的肺炎小鼠的作用及机制.方法 构建人肺细胞(A549)炎症模型,通过酶联免疫吸附试验(ELISA)检测克洛己新干混悬剂对细胞内白细胞介素(IL)-6和IL-8水平的影响,通过Western印迹检测克洛己新干混悬剂对PI3K/AKT信号通路的影响.构建PA诱导的肺炎小鼠模型,口服不同剂量克洛己新干混悬剂,分为5组:对照组,模型组,低剂量组〔10 mg/(kg·d)〕,中剂量组〔30 mg/(kg·d)〕,高剂量组〔50 mg/(kg·d)〕,然后通过苏木素-伊红(HE)染色观察各组小鼠肺组织的病理变化情况,比较各组支气管肺泡灌洗液(BALF)体积和肺湿/干重比以评估小鼠肺水肿情况,采用ELISA检测各组小鼠血清IL-6、IL-8、肿瘤坏死因子(TNF)-α和RANTES水平,并通过Western印迹检测各组小鼠肺组织内PI3K/AKT信号通路活性.结果 MTT结果显示,克洛己新干混悬剂浓度在0.1～3.0 mg/ml的浓度内对A549细胞未表现出明显的细胞毒性.通过TNF-α刺激A549细胞以诱导细胞产生炎症反应.ELISA结果显示,TNF-α诱导后细胞内IL-6和IL-8的表达水平相对于对照组显著上升(P<0.05).高浓度组、中浓度组和低浓度组IL-6和IL-8水平均较TNF-α组明显降低(P<0.05).Western印迹检测结果显示,TNF-α诱导后细胞内PI3K/AKT信号通路被激活(P<0.05),高浓度组、中浓度组和低浓度组的克洛己新干混悬剂处理后细胞内PI3K/AKT信号通路的激活受到明显抑制(P<0.05).通过PI3K/AKT信号通路抑制剂(LY294002)抑制TNF-α诱导的A549细胞PI3K/AKT信号通路的激活.Western印迹检测结果显示,使用LY294002后细胞内PI3K/AKT信号通路的激活受到显著抑制(P<0.05).使用LY294002后A549细胞内IL-6和IL-8水平明显降低(P<0.05).HE染色结果显示,接种PA后模型组小鼠肺组织中观察到明显的脓性渗出物,中浓度组、高浓度组克洛己新干混悬剂给药10 d后可明显减少PA肺炎小鼠肺组织的脓性渗出物,低浓度组克洛己新干混悬剂给药并未表现出这种效果.TNF-α组BLAF体积、湿重/干重、IL-6、IL-8、TNF-α、RANTES水平均显著高于对照组(均P<0.05);低、中、高浓度组上述指标水平均显著低于TNF-α组,且至浓度依赖性(均P<0.05).Western印迹结果显示,PA肺炎小鼠肺组织内p-PI3K和p-AKT的表达明显增加,克洛己新干混悬剂处理后其肺组织内p-PI3K和p-AKT的表达随着药物剂量的增加而减少(均P<0.05).结论 克洛己新干混悬剂通过PI3K/AKT途径在体外有效抑制炎症细胞中炎症因子的表达,也可通过PI3K/AKT途径显著降低PA肺炎小鼠的肺损伤和肺水肿情况,并显著抑制PA肺炎小鼠血清炎症因子的表达.