LINC01139靶向miR-1262影响卵巢癌细胞增殖和侵袭及迁移的机制

目的 探讨长链基因间非编码RNA01139(LINC01139)在卵巢癌细胞增殖、侵袭和迁移中的可能机制.方法 采用基因表达谱交互分析(GEPIA2)数据库分析LINC01139在乳腺癌组织的表达.qRT-PCR检测正常卵巢IOSE-80以及卵巢癌SKOV3、A2780、OVCAR3和A547细胞的LINC01139、微小RNA1262(miR-1262)mRNA表达.RNA结合蛋白免疫沉淀实验(RIP)检测LINC01139在细胞中的定位.Starbase数据库预测LINC01139与miR-1262的靶向关系,荧光素酶报告基因验证二者的结合情况.4种卵巢癌细胞中LINC01139 mRNA表达最高的为SKOV3.使用Lipo-fectamineTM2000将靶向LINC01139长链非编码RNA(lncRNA)的siRNA#1、siRNA#2、siRNA#3及加扰的阴性对照siRNA转染SKOV3细胞,得到敲低组1、敲低组2、敲低组3和敲低对照组,未进行转染的细胞作为空白对照组.qRT-PCR检测各组miR-1262 mRNA表达,筛选miR-1262 mRNA表达最高的敲低组2.向敲低组2加入miR-1262抑制剂,CCK8法、细胞克隆实验、Transwell和划痕实验检测敲低对照组、敲低组2、敲低组2+miR-1262抑制剂组(敲低组2+抑制组)及敲低组2+抑制对照组的细胞增殖能力、克隆形成数目、结晶紫染色、侵袭和迁移能力.结果 GEPIA2数据库预测LINC01139在卵巢癌表达上调,在正常卵巢细胞IOSE-80(1.000±0.059)以及卵巢癌细胞系SKOV3(3.031±0.139)、A2780(2.470±0.218)、OVCAR3(2.803±0.075)和A547(2.010±0.074)中表达上调,LINC01139 mRNA在SKOV3细胞中表达最高,F=119.4,P<0.001;故选择SKOV3细胞进行下一步实验.核质分离实验显示,LINC01139主要位于细胞质中,t=16.70,P<0.001.免疫沉淀实验表明,LINC01139可以作为内源性RNA与miRNA相互作用,t=42.52,P<0.001.Starbase数据库分析显示,LINC01139和miR-1262存在7个互补碱基.双荧光素酶报告基因实验结果显示,miR-1262能与pmirGLO-LINC01139-WT结合,抑制荧光信号强度,t=15.42,P<0.001;LINC01139进行定点突变后,荧光信号强度不变,t=1.08,P=0.526.miR-1262 mRNA在卵巢癌细胞SKOV3(0.302±0.015)、A2780(0.509±0.037)、OVCAR3(0.406±0.024)和A547(0.437±0.028)中表达均低于正常卵巢细胞(0.980±0.050),均P<0.001;在SKOV3细胞中表达最低,F=191.5,P<0.001;敲低LINC01139后,PCR测定敲低组2表达量最低,F=139.2,P<0.001;选择敲低组2进行下一步实验.PCR检测显示,敲低LINC01139后miR-1262表达量增强,F=203.8,P<0.001.CCK-8实验表明,在转染24、48和72 h后,敲低组细胞增殖活性低于对照组,P24 h=0.027,P48 h<0.001,P72 h<0.001;在转染48、72 h后,与敲低组+抑制对照组相比,敲低组2+抑制组细胞增殖活性升高,P48 h=0.004,P72 h=0.001.克隆实验表明,敲低LINC01139后结晶及克隆数减少,t=10.46,P<0.001;而在加入miR-1262抑制剂后,逆转了这种变化,F=36.6,P<0.001.Transwell实验检测显示,敲低LINC01139后紫色结晶明显减少,P<0.001;而在加入miR-1262后紫色结晶增多,P<0.001.对比正常组,敲低组2细胞迁移能力下降,P<0.001;而在加入miR-1262抑制剂后,逆转LINC01139抑制细胞迁移的能力,F=52.5,P<0.001.结论 miR-1262可抑制卵巢癌细胞的增殖、侵袭和迁移能力,LINC01139通过下调miR-1262表达影响卵巢癌细胞的增殖、侵袭和迁移能力.