2G型肢带肌营养不良症斑马鱼疾病模型的构建

目的 构建2G型肢带肌营养不良症(LGMD2 G)斑马鱼疾病模型,并初步探讨其致病机制.方法 通过CRISPR/Cas9基因编辑技术进行sgRNA制备、显微注射、tcap基因纯合突变斑马鱼筛选,构建tcap基因功能缺失的纯合突变斑马鱼.通过石蜡切片和苏木精-伊红(HE)染色观察野生型(WT)斑马鱼和tcap基因纯合突变斑马鱼的骨骼肌肌原纤维形态.使用新一代斑马鱼游泳速度测试系统检测WT斑马鱼(A组)和tcap基因纯合突变斑马鱼(B组)的最大游泳速度.将WT斑马鱼胚胎分别经空白处理、漂白剂处理、剪切损伤处理、加兰他敏处理,分别作为C、D、E、F组,采用原位杂交实验检测C～F组斑马鱼胚胎tcap mRNA表达情况.再将WT斑马鱼胚胎和M1型tcap基因纯合突变斑马鱼胚胎分为WT斑马鱼胚胎空白对照组(G组)、WT斑马鱼胚胎加兰他敏处理组(H组)、M1型tcap基因纯合突变斑马鱼胚胎空白对照组(I组)和M1型tcap基因纯合突变斑马鱼胚胎加兰他敏处理组(J组),应用实时荧光定量PCR(RT-qPCR)技术检测C～F组斑马鱼胚胎tcap mRNA相对表达量,检测G～J组斑马鱼胚胎p53和p21 mRNA的相对表达量.结果 核酸电泳结果显示成功合成了长约100 bp的斑马鱼tcap基因编辑所需sgRNA;DNA测序结果显示筛选获得了2种tcap基因纯合突变斑马鱼.HE染色实验结果显示,与WT斑马鱼相比,tcap基因纯合突变斑马鱼的骨骼肌肌原纤维明显紊乱.斑马鱼最大游泳速度检测实验结果显示,相较于A组,B组斑马鱼的最大游泳速度显著降低(t=3.32,P＜0.05).原位杂交实验结果显示,与C组相比,D～F组斑马鱼胚胎中tcap mRNA表达量明显增加.RT-qPCR实验结果显示,C～F组斑马鱼胚胎中tcap mRNA相对表达量比较差异有显著性(F=21.70,P＜0.05),其中D～F组明显高于C组(t=4.95～35.44,P＜0.05);G～J组斑马鱼胚胎中p53和p21 mRNA相对表达量比较差异有显著性(F=8.45、33.04,P＜0.05),其中J组明显低于H、I组(t=3.24～8.94,P＜0.05).结论 成功构建了tcap基因功能缺失斑马鱼LGMD2G模型,tcap基因功能缺失导致p53基因下调可能是LGMD2G致病机制之一.