分化抑制因子1和3通过Wnt/β联蛋白和Shh通路共同调节结直肠癌细胞的干性

目的 探讨分化抑制因子3(Id3)协同Id1对结直肠癌细胞干性的影响,并阐明其可能的机制.方法 应用慢病毒感染系统Id1短发夹RNA(shRNA)质粒构建Id1单基因敲减(sh-Id1)、sh-Id3和双基因敲减(sh-Id1Id3)的肠癌HCT116细胞株,荧光显微镜下观察荧光强度,实时荧光定量PCR和Western印迹法检测敲减效果.实验分为4组:HCT116空载质粒对照组(简称对照组)、sh-Id1组、sh-Id3组和Sh-Id1Id3组.实时无标记细胞检测技术(RTCA)检测细胞增殖信号,克隆形成实验检测细胞克隆形成数量和直径,流式细胞术AnnexinⅤ/PI法检测细胞凋亡,体外无血清悬浮培养法检测细胞成球的数量和大小,流式细胞术检测基因敲减的HCT116细胞CD24和CD133表达;Western印迹法检测基因敲减的HCT116细胞及过表达c-myc后CD24、CD133、EpCAM、Oct4、EZH2、Lgr5和β联蛋白表达水平.结果 荧光显微镜下可见对照组、sh-Id1组、sh-Id3组和Sh-Id1Id3组细胞绿荧光率均>90％;实时荧光定量PCR和Western印迹结果显示,与对照组相比,sh-Id1组Id1表达降低(均P<0.01),sh-Id3组Id3表达降低(均P<0.01),sh-Id1Id3组的Id1和Id3表达均降低(均P<0.01),说明sh-Id1,sh-Id3和sh-Id1Id3的HCT116细胞株构建成功.RTCA结果显示,与对照组相比,sh-Id1,sh-Id3和sh-Id1Id3组细胞增殖信号比对照组显著降低(P<0.05).克隆形成实验结果显示,sh-Id1,sh-Id3和sh-Id1Id3组克隆形成的数量及大小均比对照组显著降低(P<0.05).流式细胞术检测细胞凋亡结果显示,sh-Id1,sh-Id3和sh-Id1Id3组细胞凋亡显著高于对照组(P<0.05);无血清悬浮培养实验结果显示,sh-Id1,sh-Id3和sh-Id1Id3组细胞球性形成率均比对照组显著降低(P<0.05).流式细胞术结果显示,与对照组相比,sh-Id1,sh-Id3和sh-Id1Id3组中CD133+和CD24+细胞比例均显著降低(P<0.05),且上述结果中,sh-Id1Id3组与sh-Id1和Sh-Id3组相比显著降低(P<0.05).Western印迹结果显示,与对照组相比,sh-Id1,sh-Id3和sh-Id1Id3组CD24、CD133(CD133/2亚型)、EpCAM、Oct4、EZH2、β联蛋白、Lgr5蛋白表达均显著性下调(P<0.05).sh-Id1、sh-Id3和sh-Id1Id3组中Wnt通路的下游分子c-myc、周期蛋白D1和凋亡抑制因子蛋白水平均明显下降(P<0.05),同时Shh通路关键分子GLI1,GLI2和Shh蛋白水平明显下调(P<0.05),兔抗人Hedgehes(PTCH)2、融合抑制剂(SUFU)显著升高(P<0.05).实验过表达c-myc后,sh-Id1,sh-Id3和sh-Id1Id3降低的干性标志物CD133,Oct4,EZH2,EpCAM和Lgr5蛋白表达均重新上调(P<0.05).结论 Id3和Id1通过Wnt/β联蛋白、Shh通路共同调控直肠癌细胞的干性相关蛋白的表达.