一种体外多终点遗传毒性检测方法

目的 建立一种操作简单、快速和准确的体外多终点遗传毒性检测方法.方法 将组蛋白γ-H2AX、P53蛋白、磷酸化组蛋白H3(p-H3)以及活化多腺苷二磷酸核糖聚合酶(PARP)4个生物标志物整合到γ-H2AX灶点试验中.DNA断裂剂依托泊苷(未加S9条件下,0.2,0.4,0.8和1.6 mg·L-1)、环磷酰胺(S9条件下,3.75,7.5,15和30 mg·L-1)和非整倍体诱导剂秋水仙素(未加S9条件下,0.0063,0.0125,0.025和0.05 mg·L-1)处理TK6细胞24 h,收获细胞、固定,洗涤后加入抗体标记,流式细胞仪检测γ-H2AX、P53蛋白和p-H3荧光强度.选择4种不同作用机制的DNA断裂剂(有S9条件下,丝裂霉素C 0.05,0.1和0.2 mg·L-1,甲磺酸甲酯3,6和12 mg·L-1,苯并芘0.5,1和2 mg·L-1,顺铂2.5,5和10 mg·L-1;无S9条件下,分别加丝裂霉素C 0.025,0.05,0.1 mg·L-1,甲磺酸甲酯1.5,3和6 mg·L-1,苯并芘25,50和100 mg·L-1,顺铂1.25,2.5和5 mg·L-1)、2种非整倍体诱导剂(S9条件下,长春新碱0.005,0.01和0.02 mg·L-1,紫杉醇0.02,0.04和0.08 mg·L-1;未加S9条件下,长春新碱0.01,0.02和0.04 mg·L-1,紫杉醇0.005,0.01和0.02 mg·L-1)和3种不具有遗传毒性的化合物(有/无S9条件下,氯化钠125,250和500 mg·L-1,氨苄青霉素G 125,250和500 mg·L-1,盐酸普萘洛尔15,30和60 mg·L-1),对该方法进行验证.结果 在方法建立阶段,与溶剂对照组相比,无S9依托泊苷组和有S9的环磷酰胺组γ-H2AX和P53蛋白荧光强度增加,且依托泊苷组1.6 mg·L-1和环磷酰胺30 mg·L-1组组荧光强度为溶剂对照组的2倍以上,p-H3阳性细胞比例无显著升高;秋水仙素组γ-H2AX和P53蛋白荧光强度无明显变化,p-H3细胞比例为溶剂对照组2倍以上.在方法验证阶段使用多种不同作用机制的化合物验证得到的灵敏度(6/6)和特异性(3/3)均较高.结论 建立了体外多终点遗传毒性检测方法,该方法具有应用于药物早期遗传毒性筛选和遗传毒性评价的潜力.