壳聚糖/海藻酸钠水凝胶顺序释放BMP/WNT信号通路激活剂促成骨细胞分化的体外实验研究

目的:通过组织工程策略构建顺序释放骨形态发生蛋白(bone morphogenetic protein,BMP)和WNT信号通路激活剂的双层复合材料,并研究其在体外对成骨细胞分化的作用.方法:用CCK-8法、碱性磷酸酶(alkaline phos-phatase,ALP)染色法和茜素红染色法分别检测BMP信号通路激活剂他克莫司(tacrolimus,FK506)和WNT信号通路激活剂6-溴靛玉红-3-肟(6-bromoindirubin-3-oxim,BIO)对前成骨细胞系MC3T3-E1增殖活性和成骨向分化的影响,筛选出最合适的药物浓度;制备壳聚糖/海藻酸钠支架材料,采用称量法测定材料的降解曲线,制备内层壳聚糖载BIO、外层海藻酸钠载FK506的支架材料,采用紫外分光光度计测定药物的释放;制备内外单载不同药物的支架材料,用ALP染色法和茜素红染色法检测载药复合材料对前成骨细胞系MC3T3-E1成骨向分化的作用,应用实时定量聚合酶链式反应(real-time quantitative polymerase chain reaction,RT-qPCR)法检测载药支架材料对前成骨细胞系MC3T3-E1成骨相关基因表达的影响.结果:在适宜范围内,FK506处理的细胞早期ALP活性较BIO处理的细胞更强,且FK506促进ALP活性最适合的质量浓度为2.0μg/mL;茜素红染色结果表明,BIO在0.1μmol/L时,细胞表现出更强的钙结节形成能力.支架材料缓慢稳定降解至第35天,期间FK506和BIO顺序释放,药物在14 d内基本释放完毕.应用载药材料浸提液ALP染色的支架材料和茜素红染色结果显示,内载BIO外载FK506的实验组相比较于其他组表现出更强的成骨向分化能力;RT-qPCR结果显示,内载BIO外载FK506的支架材料能够显著促进成骨相关基因Runx2和OCN的表达.结论:以壳聚糖/海藻酸钠为支架材料,内层壳聚糖载WNT信号通路激活剂BIO,外层海藻酸钠载BMP信号通路激活剂FK506,两者顺序释放,即先激活BMP信号通路,后激活WNT信号通路,能够在体外促进MC3T3-E1细胞的成骨向分化,为临床治疗骨缺损,促进骨再生提供新思路.