肽脱甲酰基酶在偶极离子修饰亲水磁珠表面的固定化及表征

目的 比较表面修饰偶极离子且带Ni2+-NTA或羧基的两种亲水磁珠对结核分枝杆菌肽脱甲酰基酶(Mycobacterium tuberculosis peptide deformylase,MtPDF)的固定化效果,探讨适于磁分离联用HPLC-MS筛选MtPDF配体混合物库的靶酶固定化方案.方法 将N端带有6xHis标签MtPDF的质粒pET-28a(+)导入E.coli BL21(DE3)重组表达,使用镍离子螯合亲和层析介质纯化后表征其酶学性质.将MtPDF与Ni2+-NTA或羧基磁珠偶联并比较其固定化容量、保留活性、固定化前后酶稳定性及对抑制剂放线酰胺素(Actinonin)的响应.结果 Ni2+-NTA磁珠固定MtPDF的容量为(99.7±4.5)mg/g(n = 3);最优投料比酶量∶磁珠量=1∶15时,固定化酶保留活性为(107.2±13.9)％(n = 3),在0℃、pH = 7.5缓冲液中振摇3 h活性仅保留43％.羧基磁珠活化后通过酰胺键共价固定MtPDF的容量为(36.9±2.6)mg/g(n=3);最优投料比酶量∶磁珠量=1∶60时,固定化酶保留活性为(102.6±15.4)％(n=3),与Ni2+-NTA磁珠固定化保留活性相当;在0℃、pH7.5缓冲液中振摇8 h活性无显著改变;羧基磁珠固定化酶对Actinonin的抑制响应与游离酶无显著差异(P＞0.05).结论 羧基磁珠固定化MtPDF酶活更稳定,不影响抑制剂响应,适于混合物库中MtPDF高亲和力配体筛选.