AcMNPV LEF-10第21位突变对其活性的影响

[目的]对苜蓿银纹夜蛾核型多角体病毒(AcMNPV)晚期表达因子LEF-10的第21位保守氨基酸残基进行饱和点突变,研究该位点突变对AcMNPV活性的影响,为进一步研究LEF-10朊病毒特性及其在病毒复制中的作用奠定基础.[方法]同源序列比对发现,LEF-10第21位亮氨酸残基高度保守.对pTriEx质粒载体上LEF-10第21位的亮氨酸残基通过异位回补进行饱和突变,将构建好的重组质粒与线性化的Bacmid△lef-10共转染草地贪夜蛾Sf9细胞构建重组病毒,研究LEF-10第21位上不同氨基酸残基对病毒活性的影响.同时联用Red/ET基因敲除系统和rpsl反向筛选系统对AcMNPV Bacmid的LEF-10基因进行原位突变,突变后的线性化Bacmid与pTriEx-p(p10)-dsRed质粒共转染草地贪夜蛾Sf9细胞构建原位突变型病毒,研究点突变对重组病毒活性的影响,并通过流式细胞术检测突变型病毒对晚期基因表达的影响.[结果]异位回补点突变重组病毒和原位点突变重组病毒转染和感染Sf9细胞的结果均表明,当LEF-10第21位亮氨酸残基突变为异亮氨酸残基、丙氨酸残基、缬氨酸残基、脯氨酸残基、半胱氨酸残基和甲硫氨酸残基时,可以拯救LEF-10缺陷型病毒,并产生具有感染性的重组病毒,但其他突变型重组病毒均为致死突变.将7种原位突变重组病毒分别以高MOI(MOI=10)和低MOI(MOI=1)感染Sf9细胞,结果表明低MOI感染Sf9细胞时,7种重组病毒外源蛋白的表达水平相当;高MOI感染Sf9细胞时,7种重组病毒外源蛋白的表达水平差异明显,其中突变为丙氨酸残基的重组病毒将外源蛋白的表达维持在较高水平.[结论]LEF-10第21位氨基酸残基对其功能起着至关重要的作用,该位点氨基酸残基的性质影响AcMNPV的活性.