基于A型塞内卡病毒VP3蛋白间接ELISA抗体检测方法的建立

[目的]建立基于VP3蛋白检测血清中A型塞内卡病毒(SVA)抗体的间接ELISA方法,为临床上猪群SVA感染及未来疫苗免疫效果评价提供有效手段.[方法]克隆SVA的VP3基因,将其与pQE-30表达载体连接,并进行原核表达,对表达的蛋白进行纯化和鉴定.用纯化的重组VP3蛋白(rVP3)作为包被抗原,通过矩阵法优化ELISA反应条件,建立检测SVA抗体的间接ELISA方法,通过对已知背景的200份SVA阴阳性血清进行检测以确定临界值,并对该方法的特异性、敏感性、重复性和稳定性进行验证.将采自SVA灭活疫苗免疫猪不同时期的160份血清,分别用该试验建立的方法及本课题组前期建立的基于VP1蛋白的间接ELISA方法进行检测,对比两者检测结果.[结果]成功克隆717 bp的VP3基因,表达出分子质量约为32 ku的VP3重组蛋白(rVP3).Western Blot试验结果表明,纯化的rVP3蛋白具有良好的反应原性.建立了基于VP3蛋白的SVA间接ELISA检测方法,当样本OD450(S)/阳性对照OD450(P)＞0.138时判定为SVA抗体阳性.该方法特异性强,与FMDV(O/A型)、PRV、PRRSV、CSFV病原阳性血清均无交叉反应;敏感性较好,检测出的阳性血清最高稀释倍数与中和试验基本一致;重复性和稳定性好,批内变异系数小于4％,批间变异系数小于9％.160份血清检测结果表明,两种方法在不同时期的抗体阳性检出率略有差异.[结论]建立了基于VP3蛋白的SVA间接ELISA检测方法,该方法具有较好的特异性、敏感性、重复性和稳定性.