基于CRISPR/Cas9介导的同源重组技术构建TK、gE和gI基因缺失的伪狂犬病病毒

为构建TK、gE和gI基因缺失的伪狂犬病病毒(pseudorabies virus,PRV),采用CRISPR/Cas9介导的同源重组技术,对从湖北某猪场送检的病料中分离到的PRV HB2017株进行基因编辑,并利用蚀斑纯化等方法获取基因缺失株.随后,采用PCR、基因测序、间接免疫荧光试验、生长曲线测定及安全性和效力试验对基因缺失株的特性进行初步研究.结果显示:PRV HB2017株的TK、gE和gI基因已缺失,缺失毒株PRV HB2017ΔTKΔgE/gI与亲本毒株PRV HB2017株在PK-15细胞中的生长曲线差异不明显且具有较高的病毒滴度;PRV HB2017ΔTKΔgE/gI株传代至30代,TK和gE/gI基因缺失部分序列稳定,不能恢复;PRV HB2017ΔTKΔgE/gI株对仔猪是安全的;将该基因缺失株以106.0 TCID50和107.0 TCID50的病毒剂量接种仔猪,可保护仔猪免受108.0 TCID50病毒剂量强毒的攻击.