绵羊磷脂酶C-γ1基因克隆及生物信息学分析

本研究旨对绵羊磷脂酶C-γ1 (PLC-γ1)基因预测序列进行筛选鉴定,获取PLC-γ1基因序列并对其生物信息学进行分析.根据GeneBank(登录号:NC 040264.1)及Ensembl(登录号:ENSOARG00000001700.1)给出的绵羊PLC-γ1的4种不同预测的转录本的编码区(CDS)区进行BLAST对比,在非同源区内两端设计引物,从绵羊卵巢提取总RNA并转录成cDNA,运用RT-PCR方法扩增该特异性片段,胶回收后测序,经BLAST比对筛选出和与该片段一致基因序列.根据筛选序列的引物,运用LA Taq(GC Buffer)高保真酶对绵羊PLC-γ1基因进行PCR扩增,胶回收产物连接PUC57-T载体并转化大肠杆菌DH5α感受态细胞,挑选单克隆进行测序.利用生物信息学技术对该基因及编码的氨基酸序列进行分析.结果 显示,试验成功扩增出非同源片段330 bp,经BLAST对比分析,预测的转录本X3预测序列与其一致,连接PUC57-T载体,经测序成功扩增3870 bp的绵羊PLC-γ1基因.绵羊PLC-γ1基因与山羊关系紧密,与牛、马、猪等家畜具有较强的进化关系,蛋白分子式为C6582H10160N1812O1962S58.理论分子质量为147.9 ku,存在于细胞质内,且不具备跨膜性,无信号肽,为亲水性弱酸不稳定蛋白.该基因N、C端GC含量偏高,分别达80％、70％以上,具备SH2、SH3、C2等高度保守结构域,二级结构中α-螺旋、延伸链、β-转角、无规则卷曲占比分别为36.46％、16.14％、5.04％和42.36％,磷酸化位点有112个,Y428、Y509和S514为关键磷酸化位点.本研究结果为绵羊PLC-γ1蛋白表达研究提供了理论依据,对研究新疆地方品种羊的胚胎发育、提高受精率等具有重要意义.