气肿疽梭菌CctA基因的原核表达及其间接ELISA检测方法的建立

研究旨在原核表达气肿疽梭菌细胞毒素A(CctA)基因,用纯化的重组蛋白建立其间接ELISA检测方法,并验证气肿疽梭菌疫苗的免疫效果.利用大肠杆菌密码子的偏爱性优化CctA基因序列,克隆至原核表达载体pET-28a(+),双酶切鉴定原核表达质粒pET28a-CctA并测序.将重组质粒转入大肠杆菌,经IPTG诱导得到高表达的重组CctA包涵体蛋白.包涵体蛋白变性后经镍(Ni)柱纯化,SDS-PAGE检测其纯化效果.以豚鼠抗气肿疽梭菌抗血清为一抗,用Western blotting方法检测重组CctA蛋白的反应原性.用棋盘滴定法建立间接ELISA检测方法,以复性后的重组CctA蛋白作为检测抗原,摸索抗原包被浓度、封闭液的种类及浓度、抗体的最适稀释度和反应条件等.选用3批气肿疽灭活疫苗免疫豚鼠后采集血清,同时用攻毒和间接ELISA两种方法验证疫苗的免疫效力.质粒双酶切结果显示,得到大小约853 bp的条带,与预期相符,且测序结果正确.SDS-PAGE结果表明,成功表达并纯化大小为35 ku的重组CctA蛋白.Western blotting结果显示,豚鼠抗气肿疽梭菌抗血清与重组CctA蛋白具有良好的反应原性.建立的间接ELISA法的最适条件为:抗原的包被浓度为0.5 μg/mL,于4℃包被过夜;封闭液选择10％胎牛血清,37℃孵育2 h;二抗的稀释度为1:8 000;室温避光显色10 min后终止反应,测定D450nm值.当P/N＞4.6时,间接ELISA法检测结果与豚鼠攻毒试验结果拟合度较好.本研究成功表达CctA基因并纯化了重组CctA蛋白,建立的以重组CctA蛋白为检测抗原的间接ELISA检测方法,有望成为气肿疽灭活疫苗免疫效果验证的替代方法.