牛IRF7蛋白的原核表达及多克隆抗体的制备

本研究旨在通过原核表达系统表达牛干扰素调节因子7(interferon regulatory factor 7,IRF7)蛋白,并对其进行纯化,进而制备高纯度的牛IRF7兔多克隆抗体.使用生物信息学软件预测并分析牛IRF7潜在的生物学功能,参考GenBank已公布的牛IRF7基因序列(登录号:NM_001105040.1)设计引物,利用PCR技术从牛病毒性腹泻病毒(Bovine viral diarrhea virus,BVDV)感染的MDBK细胞中扩增牛IRF7基因,连接至pMD19-T克隆载体,提取质粒连接至原核表达载体pET-28a(+),转化大肠杆菌DH5α感受态细胞,构建重组质粒pET-28a-IRF7.将重组质粒pET-28a-IRF7转化大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞,经IPTG诱导后,通过SDS-PAGE进行表达产物的分析与鉴定.通过Western blotting鉴定多克隆抗体的特异性,间接ELISA测定兔抗牛IRF7多克隆抗体效价,经BVDV感染细胞后,实时荧光定量PCR检测抗病毒因子IRF7的表达.生物信息学分析发现,IRF7蛋白不存在跨膜结构域,无信号肽,存在较多磷酸化位点,二级结构主要以无规则卷曲为主,与三级结构的三维模型一致,说明该蛋白可能存在很好的抗原潜力.PCR成功扩增出大小为1 497 bp的IRF7基因片段,成功表达牛IRF7蛋白,分子质量约为60 ku,间接ELISA测得兔抗牛IRF7多克隆抗体效价为1 ∶ 128 000,并可与牛IRF7蛋白发生免疫反应,感染BVDV毒株的MDBK细胞中IRF7表达量下降;BVDV感染过表达IRF7后的细胞发现,IRF7能显著促进干扰素-β(IFN-β)的表达(P＜0.05).综上,本研究成功表达纯化了牛IRF7蛋白,并制备兔抗牛IRF7多克隆抗体,为阐明牛IRF7在先天免疫抗病毒应答的分子机制提供了材料.