新疆株猪圆环病毒3型Cap基因的序列分析及原核表达

克隆并原核表达新疆株猪圆环病毒3型(PCV3)衣壳蛋白(Cap)基因,为PCV3检测试剂的研发奠定基础.采用PCR扩增PCV3新疆分离株的Cap基因,采用Chou-Fasman法、Karplus-Schulz法、Kyte-Doolittle法、Emini法和Jameson-Wolf法预测蛋白的二级结构、蛋白质骨架区的柔韧性、亲水区/疏水区、可及性和抗原指数,将PCV3 Cap基因克隆到pEASY-Blunt Simple载体,经Hind Ⅲ、Nde Ⅰ双酶切,亚克隆至原核表达载体pET-30a(+),构建重组质粒pET30a-PCV3-Cap,测序验证后转入大肠埃希氏菌BL21(DE3)感受态细胞,通过IPTG诱导表达,采用SDS-PAGE和Western blot对表达的重组蛋白进行分析鉴定.结果显示,成功扩增并克隆到新疆株PCV3 Cap基因,通过序列分析发现所获PCV3 Cap基因与参考毒株的同源性为98.0％?98.6％之间,推导氨基酸有6个点突变,分别位于24、27、29、56、75、77和150aa位置;在11-17、37-41、54-60、97-101、119-134、138-140、142-146、155-160、170-172、175-181 和192-202aa含有潜在B细胞抗原表位.构建了重组原核表达质粒pET30a-PCV3-Cap,并在大肠埃希氏菌中表达了重组PCV3 Cap蛋白,分子质量约为32 ku,该重组蛋白以包涵体的形式存在,Western blot鉴定表明,带His标签的重组蛋白能被His单克隆抗体识别.成功克隆并原核表达了新疆株PCV3衣壳蛋白,为PCV3诊断试剂的研发奠定了基础.