利用CRISPR/Cas9技术编辑BADH2-1/BADH2-2创制香米味道玉米新种质

[目的]香味是作物的重要食味品质之一.2-乙酰-1-吡咯啉(2-acetyl-1-pyrroline,2-AP)是主要香味物. BADH2是控制水稻等作物香味性状的关键基因,敲除该基因可以产生香味稻米.利用CRISPR/Cas9基因编辑技术在北京市农林科学院自育的玉米骨干亲本京724上敲除BADH2同源基因,以期获得有香米味道的玉米新种质材料.[方法]利用Ensembl数据库在线BLAST工具,将水稻OsBADH2蛋白序列在拟南芥、水稻和玉米蛋白序列数据库中进行序列比对,获得上述3个物种的BADH基因家族成员,并利用UniProt蛋白数据库中的结构域信息进行验证.进一步使用MEGA软件进行系统进化分析,获得玉米BADH2同源基因作为候选编辑靶标.基于CRISPR/Cas9基因编辑技术的原理,在候选基因的外显子处设计特异性靶点,并构建入CRISPR/Cas9基因编辑载体.再以玉米自交系京724为受体,利用农杆菌介导的遗传转化方法,通过磷酸甘露糖异构酶基因(phosphomannose isomerase,PMI)抗性筛选获得阳性转基因植株.转基因株系经测序明确其在靶基因中产生的突变类型.利用气相色谱质谱联用仪(gas chromatography-mass spectrometry,GC-MS)检测基因编辑株系T1籽粒中香米主要香味物质2-AP的含量,以确认京724在基因编辑前后2-AP含量的变化.[结果]系统进化分析发现,玉米中存在2个BADH2同源基因,分别命名为ZmBADH2-1和ZmBADH2-2. ZmBADH2-1位于第4染色体, ZmBADH2-2位于第1染色体.2个基因均包含15个外显子和14个内含子,第4外显子间的核苷酸序列高度同源.在2个基因的第4外显子区域设计靶点并构建入CRISPR/Cas9基因编辑载体,通过遗传转化获得28株转基因株系.PCR扩增及测序分析结果显示,其中10株材料的2个ZmBADH2s在靶点区域均发生突变,突变基因型包括双等位突变和多等位突变,突变类型为不同数量的碱基缺失和插入.质谱检测结果显示玉米ZmBADH2双基因突变体籽粒中存在与香稻同样成分的2-AP.随机选取的4个T1代基因编辑株系籽粒中,2-AP平均含量分别为438.29、404.63、348.65和161.82 μg·kg-1,而未经过编辑的京724中未检测到2-AP.[结论]利用CRISPR/Cas9技术对玉米ZmBADH2-1和ZmBADH2-2同时进行定点敲除,创制出籽粒中具有香米味道的玉米骨干亲本新种质材料.