牛副结核分枝杆菌实时荧光定量PCR检测方法的建立与应用

根据GenBank上公布的牛副结核分枝杆菌F57基因保守区域设计合成1对引物,建立了副结核分枝杆菌特异的SYBR Green Ⅰ染料实时荧光定量PCR快速检测方法.以牛副结核分枝杆菌pMD-F57重组质粒为标准品,建立标准曲线,其相关系数为0.999.该方法对副结核分枝杆菌标准菌株的检测呈阳性反应,对结核分枝杆菌、大肠杆菌、肺炎链球菌等常见微生物均呈阴性反应.该方法检测灵敏度可达10个基因拷贝,比常规PCR检测灵敏度提高100倍.重复性检测显示,该方法的组内变异系数低于0.31％,组间变异系数低于0.79％.所建立的方法具有特异性好、灵敏度高、重复性好的优点,可用于牛副结核病的诊断和监测.使用所建立的牛副结核分枝杆菌实时荧光定量PCR方法对收集自新疆地区规模化牛场的85份粪便样品和116份牛乳样品进行检测.结果 显示,新疆地区规模化牛场粪便阳性率为9.41％,奶样阳性率为5.17％,表明本地区奶牛养殖场存在一定程度的副结核分枝杆菌感染,需引起相关部门的重视.