农杆菌介导香菇URA3基因RNAi体系构建

选择香菇(Lentinula edodes)内源乳清酸核苷-5'-单磷酸脱羧酶基因(URA3)为沉默靶基因,以其功能结构保守区域451～884 bp处的反向互补序列为干扰片段,将pCAMBIA1390改造为发卡结构载体HpV、GPiE改造为双启动子载体DpV-2.采用农杆菌介导转化法侵染小米粒培养基培养的香菇菌丝,通过初筛、复筛、测序获得11个HpV转化子和38个DpV-2转化子,将其接种在PDA平板(含有0.2 g·L-1 5-FOA、100mg·L-1尿嘧啶核苷)上培养,均可以生长,而野生型菌株菌丝发生褐变且生长受到抑制.采用实时荧光定量PCR方法研究11个HpV转化子和13个DpV-2转化子URA3基因表达情况,结果表明:与野生型菌株比较,5个HpV转化子、3个DpV-2转化子URA3基因表达量显著下调,1个HpV转化子、2个DpV-2转化子URA3基因表达量极显著下调.成功构建的香菇URA3基因RNAi体系可以为香菇基因功能研究以及定向育种工作开展提供有效方法.