靶向凝血因子FⅨa-FⅧa复合物结合位点的新型抗栓抗体

目的 ·制备以内源性凝血途径中关键的凝血因子Ⅸa(coagulation factorⅨa,FⅨa)为靶点的单克隆抗体,并研究其抗栓功能及作用机制.方法 ·通过免疫小鼠、杂交瘤技术、单克隆抗体细胞表达纯化技术,制备高纯度的抗FⅨa单克隆抗体;通过酶联免疫吸附测定筛选与FⅨa具有高亲和力的单抗,利用活化部分凝血活酶时间(activated partial thromboplastin time,APTT)和凝血酶原时间(prothrombin time,PT)评估单抗的抗栓效果;然后利用发色底物法检测其对FⅨa酶活性的影响;采用计算机模拟蛋白-蛋白对接的方法预测抗体与FⅨa相互作用可能的结合位点,并通过竞争实验(间接通过发色底物法)对这一结合位点进行验证.结果 ·制备得到1种高亲和力抗FⅨa的单克隆抗体FⅨa-4;虽然它不影响PT和FⅨa的酶活性,但可显著延长APTT至88.8 s,是对照组(25.5 s)的3.5倍,并且具有浓度依赖性.蛋白-蛋白对接预测结果发现,FⅨa-4不直接与FⅨa的底物催化位点结合,而是占据了FⅨa和FⅧa的结合区域.竞争实验进一步验证了上述结果,FⅨa-4以剂量依赖的方式抑制FⅩa的生成,FⅨa-4的浓度达到400 pmol/L即可使FⅩa的生成几乎完全被抑制,而FⅧa可纠正抗体的抑制作用达到近50％.结论 ·获得抗FⅨa的单抗FⅨa-4;FⅨa-4与FⅧa竞争性结合FⅨa阻碍了FⅧa-FⅨa复合物形成,阻断FⅩ向FⅩa的转化,该抗体主要通过抑制内源性凝血途径发挥抗栓作用.