共表达腺病毒载体构建鉴定及其转染骨髓间充质干细胞观察

目的:构建并鉴定绿色荧光蛋白标记的人骨形态发生蛋白(bone morphogenetic protein,BMP)2和血管内皮生长因子(vascular endotheliel growth factor,VEGF)165双基因共表达的重组腺病毒,为研究该双基因对骨髓J间充质干细胞成骨方向诱导和体内骨缺损修复作用奠定基础.方法:从cDNA文库中PCR扩增BMP2和VEGF165目的基因,并将其插入腺病毒穿梭质粒pAd-MCMV-GFP的多克隆位点,将构建的重组穿梭质粒pAd-MCMV-BMP2-VEGF165和腺病毒辅助质粒pBHGloxAE1,3Cre共转染细胞HEK293细胞内,经历腺病毒基因重组及出毒后收集细胞,多次冻融离心获取病毒溶液(Ad-BMP2-VEGF165).进一步纯化并测定病毒滴度,随后通过转染兔骨髓间充质干细胞并检测BMP2和VEGF165双目的基因表达和倒置荧光显微镜下观察绿色荧光蛋白表达.结果:基因测序、菌落PCR,Western blotting、Real-time PCR、绿色荧光蛋白表达均表明载体Ad-BMP2-VEGF165构建成功,可稳定转染骨髓间充质干细胞内并稳定表达,经测定腺病毒载体滴度达到1×1010GPFU/ml.结论:携带人BMP2和VEGF165双基因共表达重组腺病毒载体构建成功,并能获得高滴度的病毒感染液.