两种分离纯化介质对虾肝肠胞虫孢子发芽率的影响

[目的]比较蔗糖和Percoll两种不同介质的密度梯度离心分离纯化虾肝肠胞虫(Enteroc ytozoon hepatopenaei,EHP)孢子的效果及对EHP孢子发芽活力的影响.[方法]取感染EHP的凡纳滨对虾(Litopenaeus vannamei)肝胰腺充分研磨,经3次差速离心后,设置介质质量分数为30％,60％,90％的梯度,分别进行蔗糖和Percoll密度梯度离心,比较两种介质不同分层中EHP孢子的数量和纯化效果.纯化样品分别用0.1 mol·L-1的KOH溶液、0.15 mol· L-1的HCl溶液、0.15 mol·L-1的NaOH溶液、0.025 mol· L-1 pH为11.5的磷酸盐缓冲液、0.05 mol·L-1 pH为8.8的Tris-HCl溶液、0.01 mol·L-1 pH为4.8的柠檬酸盐缓冲液等6种溶液于28℃孵育30 min,比较EHP孢子的发芽率.[结果]蔗糖密度梯度离心后EHP孢子主要分布在蔗糖质量分数为90％层的底层,数量为1.53×108个.Percoll密度梯度离心后EHP孢子主要分布在Percoll质量分数为90％层的下层,数量为2.64×107个.经Percoll或蔗糖密度梯度离心分离纯化的EHP孢子再经上述6种不同溶液处理后,孢子发芽率存在差异;经0.1 mol· L-1的KOH溶液或0.05 mol· L-1 pH为8.8的Tris-HCl溶液诱导时,两种介质分离纯化所得的EHP孢子发芽率之间差异具有统计学意义(p＜0.05).[结论]以介质质量分数为30％,60％,90％的梯度对EHP孢子进行密度梯度离心,蔗糖的分离纯化效果比Percoll更好,对EHP孢子的发芽率影响更小;经蔗糖或Percoll分离纯化的EHP孢子再经0.05 mol·L-1 pH为8.8的Tris-HCl溶液或0.025 mol·L-1 pH为11.5的磷酸盐缓冲液处理,可获得较高的发芽率.