实用型RNA聚合酶Ⅰ荧光报告系统的构建

目的 在pMDT-18克隆质粒载体的基础上,构建实用型的能够稳定转染甲型流感病毒RNPs并且可体外定量检测的RNA聚合酶Ⅰ荧光报告系统.方法 设计并人工合成人RNA聚合酶Ⅰ启动子、小鼠终止子序列及毒株A/Puerto Rico/8/34的NP基因的UTR,利用嵌合PCR方法将绿色荧光蛋白(eGFP)基因与上述元件体外连接,形成小鼠终止子-3'UTR-eGFP-5'UTR-人RNA聚合酶Ⅰ启动子报告元件,将报告元件克隆至不携带任何启动子的pMDT-18质粒载体中,构建实用型RNA聚合酶Ⅰ荧光报告质粒,转染稳定表达流感病毒A/Puerto Ric0/8/34 RNPs的HeLa细胞,观察荧光表达及测定相对荧光度.结果 该系统在转染HeLa细胞后,无任何荧光产生,而转染稳定表达流感病毒A/Puerto Rico/8/34 RNPs的HeLa细胞后24 h、36 h、48 h和60 h均有荧光产生,强度随时间逐渐增强.结论 成功构建了实用型RNA聚合酶Ⅰ荧光报告系统,有助于提高流感病毒反向遗传系统的拯救效率、研究流感病毒聚合酶功能以及探索UTR多态性对特定基因的复制或转录的影响机制,为流感工作者在病毒分子机制领域的研究搭建了可靠的技术平台.