miRNA调控昆虫精巢干细胞自我更新相关基因的保守性分析和靶标验证

[目的]发现昆虫精巢干细胞自我更新相关基因3'UTR上的保守miRNA靶位点,为深入研究昆虫精子发生进程中的miRNA-基因调控关系提供参考.[方法]使用Blast搜索27种全变态昆虫精巢干细胞自我更新相关基因,并预测这些基因的3'UTR.使用TargetScan预测这些基因3'UTR上的miRNA靶位点.对家蚕Bombyx mori和小菜蛾Plutella xylostella的Chinmo和Imp基因包含let-7-5p靶标点的3'UTR序列进行了克隆,使用双荧光素酶报告系统对其靶标关系进行验证.[结果]在27种全变态昆虫中发现了17个精巢干细胞自我更新相关基因.利用TargetScan在这些基因的3'UTR上预测到了203个保守的miRNA靶位点.其中Zfh-1,Chinmo,Ken及Imp的3'UTR上存在大量的miRNA靶位点,但miRNA靶位点数目在不同昆虫类群中也存在很大差异.其中,Chinmo及Imp 3 'UTR上的let-7-5p靶位点在昆虫中保守.分别克隆了家蚕和小菜蛾Chinmo和Imp的3'UTR,通过双荧光素酶报告系统转染239T细胞证实了let-7-5p对Chinmo和Imp两个基因的调控作用.[结论]发现在4个昆虫精巢干细胞自我更新相关基因Zfh-1,Chinmo,Ken和Imp的3'UTR上存在大量的miRNA靶标位点.其中Chinmo及Imp基因3'UTR上let-7-5p靶位点在大多数全变态昆虫中保守,双荧光素酶报告系统实验证实了家蚕和小菜蛾中let-7-5p与Chinmo和Imp存在相互作用,为进一步研究miRNA在昆虫精子发生进程中的功能提供了参考.