抑癌基因PTEN shRNA腺病毒载体的构建

目的:构建抑癌基因PTEN shRNA腺病毒载体, 探讨PTEN在哮喘患者气道重塑的作用机制.方法:设计形成短发夹序列 (shRNA) 的PTEN-shRNA引物对应的模板DNA序列, 亚克隆至 p Shuttle-GFP-U6重组穿梭载体, 构建穿梭质粒 p Shuttle-GFP-U6-PTEN-shRNA.鉴定正确后, 然后与腺病毒质粒 p Adxsi在化学感受态细胞DH5α菌株内同源重组, 得到 p Adxsi-GFP-U6-PTEN-shRNA病毒质粒, 将 p Adxsi-GFP-U6-PTEN-shRNA质粒经 Pac I线性化后转染HEK293细胞, 包装重组、并大量扩增 p Adxsi-GFP-U6-PTEN-shRNA腺病毒质粒, 氯化铯梯度离心纯化, 测病毒滴度, Western blot检测PTEN蛋白水平的表达.结果:结果证实 p Shuttle-GFP-U6-PTEN-shRNA及 p Adxsi-GFP-U6-PTEN-shRNA质粒构建正确, 收获病毒后的PCR 及Western blot检测结果均证明 p Adxsi-GFP-U6-PTEN-shRNA包被成功.结论:抑癌基因PTEN shRNA腺病毒载体成功构建, 为进一步研究PTEN基因应用于哮喘治疗提供了相关的实验基础.