利用BmNPV-家蚕表达系统包装重组腺相关病毒2型(rAAV2)研究

腺相关病毒(adeno-associated virus,AAY)是基因治疗中最常用的病毒载体之一,目前用于基因治疗的AAV多利用苜蓿银纹夜蛾核型多角体病毒表达系统(AcMNPV-sf9)包装,但较高的包装成本限制了AAV在基因治疗中的广泛应用.家蚕杆状病毒表达系统与AcMNPV-sf9系统相比,具有包装量更高、成本更低的优势,因此更适用于包装重组腺相关病毒(recombinant adeno-associated virus,rAAV).首先,将AAV2功能基因cap和rep进行序列优化后合成,克隆到杆状病毒转移载体pVL1393上,将增强型绿色荧光蛋白(enhanced green fluorescent protein,EGFP)基因和荧光素酶(luciferase,Luc)基因分别作为报告基因克隆到含有巨噬细胞病毒IE(cytomegalovirus-IE,CMV-IE)启动子的病毒转移载体pVL1393-ITRs-MCS上.随后,将构建好的转移载体分别与缺陷型家蚕杆状病毒reBmBac共转染BmN细胞系,获得分别重组有cap、rep和报告基因的家蚕杆状病毒(Bombyx mori nucleopolyhedrovirus,BmNPV).再将纯化的重组病毒(reBm-Cap2、reBm-Rep2)与reBm-EGFP、reBm-Luc分别混合后感染家蚕,收获其表达产物,纯化得到含有目的基因的rAAV病毒.利用rAAV病毒感染哺乳动物细胞后,通过检测EGFP、Luc的表达状态来验证rAAV包装成功与否.结果显示,利用家蚕杆状病毒系统成功包装了rAAV2,并且在哺乳动物细胞中实现了报告基因的表达.