问号钩端螺旋体Sigma N信号系统调控靶基因鉴定

目的:确定致病性问号钩端螺旋体(简称钩体)LA2404基因产物为Sigma N转录因子，鉴定Sigma N信号系统参与调控的下游靶基因。方法:采用生物信息学软件并根据Sigma N调控基因启动子序列特征，预测并分析钩体基因组中LA2404基因及其调控的靶基因。采用等位交换原理构建问号钩体LA2404基因敲除株(ΔLA2404)。采用实时荧光定量RT-PCR(qRT-PCR)检测ΔLA2404敲除株中候选靶基因mRNA水平变化。构建LA2404基因原核表达系统并提纯目的重组蛋白(rSigma N)。采用凝胶迁移试验(gel electrophoresis mobility shift assay, EMSA)验证Sigma N调控的靶基因。结果:致病性问号钩体黄疸出血群赖型赖株有一个Sigma N编码基因以及22个含Sigma N启动子序列的靶基因。ΔLA2404敲除株有钩体典型、活泼的运动方式，外形无明显变化。ΔLA2404敲除株中LA1188、LA2306、LA3426、LA1968、LA1313、LA3806和LA0773基因mRNA水平显著下调( P<0.05)，其他靶基因mRNA水平无明显变化。EMSA结果显示，rSigma N可与上述靶基因启动子序列结合。 结论:LA2404基因产物为Sigma N调控基因。LA1188、LA2306、LA3426、LA1968、LA1313、LA3806和LA0773的启动子序列能与转录因子Sigma N结合，上述7个基因表达受Sigma N通路调控。