EHEC O157∶H7紧密黏附素及突变体与受体Tir的结合特性研究

目的 表达纯化肠出血性大肠杆菌(EHEC) O15∶H7的紧密黏附素(intimin)及突变体intiminN916Y,并构建其转位紧密黏附素受体(translocated intimin receptor,Tir)结合片段(intimin binding domain,Tir-IBD),通过BIACore技术检测紧密黏附素及突变体intiminN916Y与Tir-IBD蛋白质相互作用特性的变化,探索特定氨基酸的突变对其黏附结合功能的影响.方法 设计引物采用PCR法自EHEC O157∶H7基因组扩增Tir-IBD的编码基因tir-ibd,TA克隆后构建原核表达质粒pET-21a(+)-tir-ibd,经测序鉴定后转化E.coli BL21( DE3),IPTG诱导表达,PAGE检测.目的蛋白经Ni-NTA亲和纯化后,再用阴离子交换柱Resource Q和分子筛柱Superdex 200进行纯化.同时按包涵体复性后纯化的方案制备紧密黏附素及突变体intiminN916Y,将所得高纯度目的蛋白Tir-IBD适当稀释后耦联BIACore3000配套的NTA芯片,在25℃和37℃条件下分别以紧密黏附素及突变体intiminN916Y作为流动相进行BIACore检测.结果 EHEC O15∶H7基因组扩增出了约270 bp的目的片段；原核表达质粒pET-21a(+)-tir-ibd经酶切及测序鉴定与设计序列一致.转化E.coli BL21( DE3)后IPTG诱导目的蛋白表达率约15％；PAGE初步测定目的蛋白的相对分子质量(Mr)约10×103,破菌后电泳证实目的蛋白为可溶表达.Ni-NTA亲和纯化和阴离子交换纯化效果明显,高纯度的Tir-IBD蛋白耦联NTA芯片,在25℃和37℃条件下对紧密黏附素及突变体intiminN916Y与Tir-IBD相互作用的BIACore检测结果显示,intiminN916Y特定氨基酸的突变对其结合能力有明显影响并呈温度依赖性.结论 EHEC O157∶H7的紧密黏附素、突变体intiminN916Y及Tir-IBD经基因克隆后获得了较好的表达,纯化后获得高纯度的目的蛋白.在此基础上建立了蛋白相互作用的BIACore检测体系,证明intiminN916Y特定氨基酸的突变对其结合能力有明显影响并呈温度依赖性.